摘要:为评价干酪乳杆菌生物合成胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)抗氧化活性，本文分离纯化高产胞外多糖的三株副干酪乳杆菌(3号、5号和7号)的胞外多糖，并对其DPPH·、·OH和O-2清除率分别进行测定，评价其体外抗氧化活性。通过分析EPS对H2O2诱导氧化损伤293T细胞的保护作用，评价其胞内抗氧化活性。结果表明，当EPS浓度为400μg/mL时，其DPPH·、·OH和O-2的清除率最高，分别为8.87%(5号)、88.94%(7号)和34.55%(7号)，其中对·OH清除能力高于抗坏血酸(65.87%)，且三株菌株之间没有明显差异。3号副干酪乳杆菌所产EPS显著提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)活性并抑制了丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)，且与多糖浓度呈正相关。因此，3株副干酪乳杆菌胞外多糖具有良好的抗氧化活性，作为天然抗氧化剂具有良好的应用潜力。
关键词:副干酪乳杆菌，胞外多糖，抗氧化活性
乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的一种糖类化合物[1]，是乳酸菌在长进化过程中适应环境的产物，不仅可以保护菌体而且因其具有调节皮肤免疫力、抗肿瘤、抗炎以及免疫调节等作用，在诸如化妆品、制药、食品等生物技术方面得以应用[2-6]。
近年来，乳酸菌胞外多糖的抗氧化性也是研究的热点[7-10]，由氧自由基引起的氧化应激(Oxidativestress)是各种退行性疾病的主要发病因素，如癌症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化和炎症[11]。在正常情况下，机体中的活性氧在细胞的生命活动中是积极存在的。机体中存在着一种自我平衡(Homeostasis)的过程，通过自身的抗氧化防护和修复机制将体内的活性氧维持在平衡状态，但是当机体处于疾病或者感染等不利的环境条件或者遭受外源自由基入侵的情况下，自由基与抗氧化剂体系之间的平衡被打破，自由基累积就会出现氧化应激[12]。研究表明，副干酪乳杆菌VL8经培养条件优化后胞外多糖产量可达263.74mg/L，并发其所产胞外多糖有较好的抑制脂质过氧化和·OH清除能力[13]。其他乳酸菌如植物乳杆菌C88胞外多糖LPC-1对羟基自由基具有良好的清除能力[14]，嗜酸乳杆菌胞外多糖也具有清除自由基、螯合金属离子、抑制脂质氧化的作用[15]，其中保加利亚乳杆菌SRFM-1胞外多糖可以对O-2、·OH、DPPH·自由基等显示出强烈的清除活性[16]。这些研究证明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面的巨大潜力，使得乳酸菌胞外多糖作为一种具有强抗氧化活性的、有效的、无毒的和有前途的抗氧化剂，是药物开发的重要候选。
本研究从四川传统发酵泡菜中分离得到的三株高产胞外多糖的副干酪乳杆菌的发酵培养液中提取其生物合成的胞外多糖，对其体内外抗氧化特性进行研究，以期为扩大乳酸菌的综合利用，以及乳酸菌胞外多糖在食品体系中作为一种具有抗氧化性质的新型添加剂提供理论基础依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
副干酪乳杆菌3号、5号和7号三株菌株均来源于昆明理工大学生命科学与技术学院应用微生物组从四川传统发酵泡菜中分离获得，并在-80℃下含20%甘油的MRS培养基中储存;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉OXOIDLTD.;葡萄糖、无水乙醇西陇化工股份有限公司;三水合磷酸氢二钾广东光华科技股份有限公司;乙酸钠、七水硫酸镁、四水硫酸锰、柠檬酸钾、碳酸氢钠、苯酚、抗坏血酸、过氧化氢、硫酸亚铁天津市风船化学试剂科技有限公司;Tween-80、DPPH自由基、亮绿、邻苯三酚Solarbio公司;三氯乙酸天津市光复精细化工研究所;乙二胺四乙酸生工生物工程(上海)有限公司;硫酸重庆川东化工(集团)有限公司;杜尔伯科极限必需培养基(DMEM)德国Invitrogen公司;MDA、SOD、T-AOC测定试剂盒上海世锋生物科技有限公司。
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1.2实验方法
1.2.1培养基配制MRS培养基:蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，三水合磷酸二氢钾2g/L，乙酸钠5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，柠檬酸三铵2g/L，Tween801mL/L。
MRS改良培养基[17]:葡萄糖20g/L，酵母粉30g/L，三水合磷酸二氢钾2g/L，乙酸钠5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，柠檬酸三铵2g/L，Tween801mL/L。
1.2.2菌株的活化与培养将三株副干酪乳杆菌从-80℃取出后按体积分数2%的接种量接种至含有5mLMRS基本培养基的试管中培养12h。传代培养2次后再按体积分数2%的接种量转接至新鲜的含有500mLMRS改良培养基的锥形瓶中37℃培养24h。
1.2.3胞外多糖分离纯化将细菌培养液于4℃、10000×g离心15min，除去细胞，在上清中加三氯乙酸(TCA)至质量分数为4%，并在室温下震荡摇匀，静置30min，10000×g离心15min去除沉淀蛋白;离心后的上清中加三倍体积的预冷无水乙醇沉淀，-20℃过夜;4℃、12000×g离心30min收集沉淀;将沉淀用ddH2O溶解，转移到经过前处理(将透析袋根据自己的需要剪成适当的长度，一般为10～20cm的小段;在大体积的质量体积比为2%碳酸氢钠和1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA，pH8)的溶液中，将透析袋煮沸10min;用蒸馏水彻底清洗透析袋;再用1mmol/L的EDTA(pH8)溶液将透析袋煮沸10min;冷却后存放于4℃冰箱中)的透析袋中透析2d，期间每8h换水一次;收集透析液后真空冷冻干燥[18]。
1.2.4总糖量测定将冷冻干燥后的三株副干酪乳杆菌胞外多糖用ddH2O溶解，利用苯酚-硫酸法[19]测定胞外多糖产量。以葡萄糖为标准品制作标准曲线，得到回归方程:y=14.929x+0.007，R2=0.9996，曲线拟合良好，并通过回归方程计算副干酪乳杆菌的胞外多糖产量。
2结果与分析
2.1总糖量测定结果
本实验采用苯酚-硫酸法测定所分离的胞外多糖产量，3号、5号、7号菌株的产量分别达(205.863±4.306)、(210.775±6.331)、(233.550±4.306)mg/L。李向菲等[22]根据产量将产胞外多糖乳酸菌分为高产(产量≥180mg/L)、中产(180>产量≥120mg/L)和低产(产量<120mg/L)胞外多糖菌株。本研究这三株菌株胞外多糖产量都高于180mg/L，根据划分标准，这三株副干酪乳杆菌均为胞外多糖高产菌株。
2.2DPPH·清除活性分析
抗坏血酸以及副干酪乳杆菌生物合成胞外多糖清除DPPH活性如图1所示。3株副干酪乳杆菌生物合成胞外多糖均具有一定清除DPPH·的能力，且对清除DPPH·的能力均表现出浓度依赖的特征，对DPPH·清除率随胞外多糖的浓度100～400μg/mL逐渐增大，当胞外多糖浓度为400μg/mL时，3号、5号、7号菌株胞外多糖对DPPH·清除率分别为6.55%、8.87%、8.80%(图1B)，但均低于抗坏血酸对DPPH·的清除率(图1A)。Zhang等[14]对植物乳杆菌C88胞外多糖抗氧化性分析得到类似的结果，他们结果显示胞外多糖对DPPH·清除活性随其浓度增加而增加，当胞外多糖浓度达1.0mg/mL时活性最大，进一步增加也不会显着影响活性，当浓度为4.0mg/mL时，其胞外多糖和抗坏血酸分别显示出DPPH自由基清除活性为52.23%和88.60%;而张玉龙等[23]筛选出的8株产胞外多糖乳酸菌中，七株乳酸菌所产胞外多糖均比抗坏血酸的DPPH·清除能力强，并且其胞外多糖的DPPH·清除能力，最高可达11.93%±0.01%，是抗坏血酸的2倍。
2.3·OH清除活性分析
在本研究中，·OH来源于Fenton反应(Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·)，以亮绿作为显色剂。胞外多糖对·OH的清除活性如图2所示。随着胞外多糖的浓度增加，清除率呈上升趋势，并且具有明显的剂量依赖关系。当胞外多糖浓度达400μg/mL时，3号、5号、7号3株副干酪乳杆菌胞外多糖对自由基清除率分别为86.57%、82.59%、88.94%，均高于抗坏血酸的清除率(65.87%)，这表明3株副干酪乳杆菌胞外多糖都具有强的·OH清除能力。Guo等[24]的研究结果也得到相同的结果，胞外多糖羟基自由基清除活性以浓度依赖的方式增加。另有研究表明，副干酪乳杆菌VL8所产胞外多糖在浓度于200μg/mL时其胞外多糖的·OH清除率与抗坏血酸就已经基本持平(41%)，并且随着EPS浓度的增加其羟基自由基清除率也有所增长[13]。这体现出本研究所分离的3株副干酪乳杆菌EPS在·OH清除方面是具有一定潜力。
2.4O-2·清除活性分析
根据图3结果来看，3株副干酪乳杆菌生物合成的胞外多糖均具有清除超氧阴离子自由基的能力。随着胞外多糖的浓度增加，对超氧阴离子自由基的清除率随之上升，在胞外多糖浓为达400μg/mL时，3号、5号、7号菌株生物合成的胞外多糖对超O-2·的清除率分别为24.86%、34.55%、19.44%，均低于抗坏血酸对·OH清除率(81.35%)，说明这三株副干酪乳杆菌所产胞外多糖对O-2具有一定的清除能力。
2.5胞外多糖缓解293T细胞氧化损伤能力评价
2.5.1丙二醛(MDA)含量丙二醛(MDA)是自由基攻击膜不饱和脂肪酸的产物可以与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤[25]，MDA含量越高说明细胞损伤越严重。本实验的3号副干酪乳杆菌胞外多糖作用H2O2诱导的293T细胞的MDA含量的结果如图4所示。将对照组293T细胞内MDA水平与模型组293T细胞(内MDA水平进行比较，在胞外多糖浓度100～400μg/mL时，MDA的水平均有显著的降低(P<0.05)。随着胞外多糖浓度的升高，MDA水平呈逐步降低的趋势，高浓度(400μg/mL)胞外多糖处理导致MDA水平最低。MDA水平的逐渐降低，表明胞外多糖在一定程度上抑制了膜脂质过氧化，保护了细胞的脂质膜，阻断了外界活性氧的侵入。有研究显示植物乳杆菌的胞外多糖能够抑制Caco-2细胞内MDA的形成，用胞外多糖处理后的胞内MDA水平显著降低(P<0.05)，并且具有剂量效应[14]，这与本研究结果一致。
2.5.2超氧化物歧化酶(SOD)活力超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)是一种源于生命体的活性物质，能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害，其活性的高低可间接反映组织中超氧自由基的含量和细胞受损程度[21]。胞外多糖作用于H2O2诱导的293T损伤细胞的SOD活性的结果如图5所示。与对照组相比模型组SOD活性显著降低，经过胞外多糖处理后SOD活性有所增加，并且随着胞外多糖浓度的升高SOD活性逐步增大。同类研究中，Zhang[14]等在对植物乳杆菌C88胞外多糖抗氧化性
注:小写字母不同代表差异显著(P<0.05);图5、图6同。的进一步研究显示，将胞外多糖预处理24h即可以恢复H2O2处理的Caco-2细胞的SOD活性，与氧化损伤模型细胞相比，高剂量的胞外多糖(100和200μg/mL)能显着提高SOD水平。白丽娟[26]利用瑞士乳杆菌SMN2-1的主要多糖组分EPS-S1处理D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型，也发现当胞外多糖为100及200mg/kg时能够极显著恢复肝脏以及脑组织中SOD活性(P<0.01)。这也表明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面所具有的潜力。本实验所用的胞外多糖能够清除H2O2造成的自由基从而恢复SOD活性。
2.5.3总抗氧化(T-AOC)能力如图6所示，将293T细胞用H2O2诱导损伤后，细胞的总抗氧化能力显著降低(P<0.05)，当用胞外多糖的处理之后，使得损伤细胞的总抗氧化能力得以逐步恢复，这表明胞外多糖对能够缓解细胞的氧化损伤。在胞外多糖浓度为100、200、300和400μg/mL时，对照组、模型组以及各多糖处理组的总抗氧化活性分别是1.480、0.575、1.069、1.480、1.932和2.056U/mL。经过不同浓度的EPS孵育后T-AOC水平显著提高(P<0.05)。从总抗氧化水平来看，高浓度(≥300μg/mL)的EPS可以提高细胞的总抗氧化能力，陈佩等[27]研究了干酪乳杆菌对HepG2细胞抗氧化功能的影响，结果谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSHPx)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活力分别提高了80%、30%和124%(P<0.05)。
总之，根据本研究中各氧化指标的检测结果，我们认为可能是由于胞外多糖清除了部分自由基，并且能够对细胞内的抗氧化系统起到辅助甚至促进的作用，保证其正常的运行，抵御H2O2对细胞的氧化损伤，使细胞得以修复。
3结论
作为一种天然的抗氧化物质，乳酸菌胞外多糖具有巨大的开发潜力，本研究所探讨的3株副干酪乳杆菌生物合成的胞外多糖在体内外均有一定的抗氧化能力。体外实验中发现，胞外多糖对羟基自由基清除能力较好。而细胞实验中发现，副干酪乳杆菌产胞外多糖作用于H2O2诱导氧化损伤的293T细胞，能够显著的提高SOD活性、总抗氧化能力并抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)。总之，这3株株副干酪乳杆菌胞外多糖具有良好的抗氧化性，作为食品添加剂有较好的运用潜力，如何增强其抗氧化性能将是之后的研究方向。
