摘要：为研究渤海湾近岸污染对远近岸海域微生态的影响，利用高通量测序技术，对渤海湾不同离岸距离的6个站位采集表层海水，进行浮游细菌群落结构分析，结合环境、空间因素探究影响其变化的主要因素。结果表明：研究区域存在环境因子的梯度变化，如氮营养盐在近岸高于远岸;细菌α-多样性在不同站位间差异不显著，但仍显示在近岸相对较高;细菌群落结构随离岸距离变化显著，γ-变形菌和拟杆菌在近岸显著富集，且与氮营养盐的含量有关;蓝细菌在远岸显著富集，且与氨氮、透明度、电导率有关;邻体矩阵主坐标单独解释部分对群落结构变异的贡献率最大(38.1%)，说明可能存在尚未测量但具有空间结构的环境变量影响群落空间分布;结合功能预测的结果推测近岸区域的富营养与烃类污染等可能影响群落变化。本文从环境和空间影响两方面探讨了渤海湾不同离岸距离的海域浮游细菌群落结构变化，为研究渤海湾海洋生态及环境保护提供一定的参考。
关键词：渤海湾;浮游细菌群落结构;地理分布;功能预测;邻体矩阵主坐标
1 引言
渤海湾位于渤海西部，是我国九大海湾之一，周围集中了海洋化工、港口、滩涂养殖和盐业等多种经济活动，是开发利用海洋资源比较活跃的地区之一[1]。随着城市化进程的加快和临港工业的发展，陆源排海污染物不断增加，倾废、船舶以及海水养殖等对海域生态环境造成巨大压力[1]。排海污水主要包括耗氧有机物、无机氮、无机磷和油类等，严重超标的污染物加之渤海湾为半封闭港湾、与外海交换能力差的特征，导致渤海湾海洋环境质量急剧恶化。微生物作为一类多样性最高的生命形式，在地球化学循环(碳循环，氮循环，硫循环，磷循环和金属循环等)中承担着重要的生态功能，复杂的群落结构、功能、相互作用及其动态变化对环境生态功能的维持有重要意义。海洋微生物群落的结构组成和特性在一定程度上反映了海洋生态系统的环境状况[2]。深入研究渤海湾微生物群落结构与分布特征对认识和预测渤海湾海洋生态功能极为重要[3]。已有的关于渤海湾微生物多样性的调查研究主要集中在对浮游细菌数量变化及与环境因子的关系等方面[4–5]，而对海洋细菌群落结构和功能多样性变化及其受环境和空间因素的影响则少有报道。近年来，越来越多的海洋生态学家开始关注自然环境中空间距离和环境因子在微生物群落结构形成和维持中的作用。在具体的研究中，空间距离代表历史因素、扩散限制等;环境因素代表当代气候、物理、化学的环境变化[6]，这两者被认为是驱动当前微生物多样性差异的主要因素[7–10]。目前，国内相关的研究主要集中在东海、南海近岸海域，如Xiong等[11]报道了东海沉积物中的细菌群落存在地理分布特征且与氮污染梯度有关系，发现空间距离对细菌群落变化的影响要高于环境因子;同时，Wang等[12]对东海沿岸浙江省区跨越8个海岸带的表层海水中浮游细菌群落结构变化规律的研究表明，环境和地理因素共同影响部分对该区域浮游细菌群落结构的变化解释度最高。Zhang等[13]对南海沿海海域400～500km范围内的总菌群和活性菌群多样性的分析表明在研究区域内细菌群落存在的地理分布特征是环境和距离衰减共同作用的结果，其中环境因子与群落组成的关系相较于地理距离与群落组成的关系更加紧密。这些研究均显示在近岸海洋环境中，微生物群落的地理分布规律均分别受空间因素和环境因素的影响，但是针对半封闭港湾的相关研究尚未见报道。
针对渤海湾而言，其地理水文环境与上述海域相比有其独特性，渤海湾是一种浅滩淤泥质海湾，海底地形自岸向海倾斜，沿岸受人类活动影响较大，半封闭港湾的特征决定了其与外海交换能力差，沿岸各类污染加剧了渤海湾的生态负担。已有的关于渤海湾微生物生态学研究更加关注浮游细菌丰度和沉积物中细菌群落的变化，如赵海萍等[14]基于浮游细菌的丰度变化对渤海湾浮游细菌分布特征进行研究，为了解渤海湾浮游细菌的生态环境状况提供了有力的数据支持;另外，刘鹏远等[15]对渤海湾表层沉积物中细菌群落结构的研究较为全面的探讨了海洋环境因素与沉积物微生物群落构成、分布与多样性的联系，其重点关注环境因子对表层沉积物群落的影响。目前，对空间因素同环境因素在渤海湾浮游细菌群落变化中的影响作用研究还较为匮乏。为进一步研究渤海湾近岸环境污染对渤海湾近岸及远岸的海洋微生物生态产生的影响，本文试图探究渤海湾湾区内从近岸到远岸接近渤海中央浅海盆地的区域内，随离岸距离的变化，浮游细菌群落的结构和组成变化，通过对营养盐等污染物含量和群落的变化进行相关研究，来回答近岸污染对渤海湾沿岸由近及远的海洋环境微生态的影响程度，并通过方差分解分析地理空间因素和环境因素对该区域细菌群落变化的贡献，进一步基于群落结构预测该区域微生物功能的空间变化特征，为深入了解微生物群落在渤海湾海洋环境中的生态功能提供参考。
2 材料和方法
2.1海水样品的采集
2014年8月中旬，采集了渤海湾38.6714°～38.6591°N，117.7273°～118.8841°E范围内6个站位(图1)的海水样品，站位划分为3个小区域：近岸站位(TJ16、TJ23、TJ27);中间站位(TJ13、TJ17);远岸站位(TJ14)。每个站点的地理坐标见表1。对每个站位采集1.5L的表层海水(0.5m)样品。随船记录环境参数(水温、湿度、盐度、电导率、溶解氧等环境参数)。采集的水样于采样船上，每个样品取500mL用经灭菌处理的100μm孔径的尼龙布预过滤后用0.2μm孔径的聚碳酸酯膜(Millipore，USA)过滤，置于预先灭菌容器中存于冰盒，4h内运回实验室储存于−80℃冰箱以待后续检测分析。剩余水样用于海水水质测定。每个站位采集3个重复。
2.2海水理化性质测定
pH、盐度、电导率和溶解氧(DO)利用探头测定(Multi3420，WTW，Germany)，其余理化性质的测定均参照标准方法(GB17378.4—2007)。活性磷酸盐含量使用钼蓝比色法测定，氨氮含量使用苯酚次氯酸盐法测定，活性硅酸盐含量使用硅钼蓝比色法测定，亚硝酸盐含量使用对氨基苯磺酰胺法测定，硝酸盐含量则使用Cd-Cu柱还原成亚硝酸盐后按照亚硝酸盐含量测定法测定。可溶性总无机氮含量则是通过将氨氮，硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量相加获得。海水中的化学需氧量(COD)使用碱性高锰酸钾法测定。
2.3细菌基因组提取与目的片段扩增、测序
利用MoBio强力水样DNA提取试剂盒(MOBIO，USA)对海水样品进行微生物总DNA提取。利用16SrRNA基因V4区引物：F515(5′–GTGCCAGCMGCCGCGGTAA–3′)和R806(5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′)[16]进行目的片段扩增。扩增子样品测序前的准备工作参照Illumina公司《16S宏基因组测序文库制备-为IlluminaMiSeq系统制备16S核糖体RNA基因扩增子》使用说明书进行。扩增后产物利用IlluminaMiseq测序仪进行高通量测序。测序样品的原始数据已上传至中国科学院北京基因组研究所大数据中心建立的组学原始数据归档库中，获取编号为CRA000481，访问网址：http://bigd.big.ac.cn/gsa。
2.4测序结果分析
测序产生的双端序列使用FLASH软件进行拼接，参数默认[17]。拼接后序列使用QIIME软件进行数据过滤[18]，过滤标准：(1)删除长度小于200bp和大于450bp的序列;(2)筛选质量大于20(即准确度99%)的序列;(3)最少有连序75%的碱基质量高于20。过滤后的序列，利用USEARCH检测嵌合体，并使用filter_fasta.py命令将其去除[19]。然后基于条形码信息对样本序列进行分配[18]。利用Uclust[19]对优质序列按相似度0.97进行聚类，并将其分配给可操作分类单元(OperationalTaxonomicUnit，OTU)。选取每个OTU中丰度最高的序列作为代表序列。代表序列基于Greengenes数据库[20]进行分类，使用PyNAST[21]基于Greengenes数据库进行BLAST比对。清除被分类到叶绿体、线粒体、古生菌、真核生物或未知序列的序列以及单序列。为了保持数据的一致性，对高通量测序数据进行抽平处理，每个样本随机选择3000条序列子集(对应样本的最小测序量)来计算样本之间的多样性、群落组成和群落距离。
2.5统计分析
根据取样点的地理坐标计算各个站位的离岸距离，对各站位营养盐含量(主要是COD、无机氮、氨氮、硝态氮、亚硝态氮、活性磷酸盐、活性硅酸盐)基于Gower距离进行Cluster聚类分析;利用KruskalWallis秩和检验对各站位间的细菌多样性、优势物种组成差异进行检验;基于Jaccard和Bray-Curtis算法，对各样本OTU组成数据进行主坐标分析(Principlecoordinateanalysis，PCoA)。
基于取样点坐标，利用趋势面分析(trendsurfaceanalysis，Trend)和邻体矩阵主坐标(principalcoordinatesofneighbourmatrices，PCNM)分析模拟各种可能的空间结构。趋势面分析是利用数学曲面模拟地理系统要素在空间上的分布及变化趋势，该方法较为粗放，主要是对数据进行除趋势处理[22];PCNM分析是基于空间坐标位置，模拟出一系列不同尺度上具有空间自相关的特征值，作为空间变量来解释不同机制引起的群落结构变化[6,23]。PCNM分析首先构建样点之间的欧式距离矩阵，削减距离矩阵规模，只保留一定规模的邻体之间的距离。其次，计算削减距离矩阵的主坐标分析，并保留具有正空间相关的特征向量[6]。最后使用保留的特征向量作为空间变量，运用于多元数据分析当中。PCNM分析可以获得很多比取样间隔更宽尺度的正交空间变量，可以对任何类型的空间结构(规则取样、不规则取样)进行建模[6]。显著的PCNM变量可以被定义为宽尺度、中尺度和微尺度变量，一般是任意设定，需要指出的是，随着PCNM轴的增加，其所代表的空间尺度逐渐减小[23]，但目前尚没有统一的方法将PCNM变量定义为宽尺度、中尺度和微尺度变量。对于宽尺度和中尺度PCNM变量可以认为是模拟的尚未测量但存在空间结构的微生境变量;微尺度PCNM变量大部分情况是模拟由群落动态产生的局部空间结构，可能与中性生物学过程有关，通常与环境变量没有关系[6]。
变差分解分析(RariancePartitioningAnalysis，VPA)可以用于评估环境变量与所有尺度的空间变量对响应变量的解释程度[6]。变差分解的目的是量化各种不同因素单独或共同解释响应变量变差的比例，其中，线性趋势可以视为产生变差的一部分来源。线性趋势可以发生在响应变量，也可以发生在解释变量，在进行变差分解之前，需要检验线性趋势的显著性，如果趋势显著，变差分解过程应考虑线性趋势的影响[6]。结合以上，以环境参数作为环境数据源，浮游细菌群落组成作为生物数据源，基于趋势面分析和PCNM分析模拟的空间结构作为空间因子数据源，构成环境因子、空间因子与物种组成矩阵，利用VPA分析环境变量和空间变量对浮游细菌群落分布的单独解释量和共同解释量。在进行上述分析之前，对原始环境数据进行对数变换，对物种数据通过海林格变换(Hellingertransform)进行中心变换。在模型构建过程中，分别对环境变量(Env)、Trend和PCNM变量进行前向选择，即根据R2准则，如果在保留的变量基础上获得的校正R2已经等于或者稍大于全模型的校正R2，则停止选择[6]。
基于线性判别分析流程(lineardiscriminantanalysis(LDA)effectsizepipeline，LEfSe)[24]确定每组的显著差异分类单元，该流程可在网址：http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/获取。取LDAscore=2.0(α=0.05)的阈值作为判别标准，选择one-against-all作为比对方式，对组间相对丰度差异显著的分类单元进行识别。基于皮尔逊相关系数衡量各变量与差异分类单元之间的关系。利用FAPROTAX工具对微生物群落功能进行预测[25]，基于Bray-Curtis算法对群落功能进行主坐标分析，并基于主坐标分析的聚类结果进行各组别群落功能的差异分析(Kruskal-Wallis秩和检验)。
3 结果分析
3.1取样站位地理环境与海水理化性质分析
结合环境参数(表1)，可以看到取样站位的水深是远岸站位最深，中间站位次之，近岸站位最浅。此外，物理环境参数，气压、电导率、盐度的变化随离岸距离变化不大，温度(水温和气温)在远岸站位较低、近岸站位较高，湿度和透明度在远岸站位较大，近岸站位较小;化学环境参数，总无机氮、亚硝酸盐和硝酸盐含量在远岸站位较低，近岸站位较高，氨氮含量则在TJ14站位含量最高，其次是TJ27、TJ17，然后是TJ23、TJ13、TJ16，氨氮含量的变化并未随离岸距离的增大而减小;活性硅酸盐和活性磷酸盐含量在近岸站位和远岸站位相差不大;DO含量在远岸站位相对高于近岸站位;COD含量则整体上近岸站位高于远岸站位，但是在远岸站位中，TJ14的COD含量明显高于中间站位(TJ13、TJ17)。基于主要营养盐，如硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮、无机氮、活性磷酸盐、活性硅酸盐、COD在各个站位海水样品中的含量，进行聚类分析，结果显示6个站位聚成3组，TJ14站位单独一组，TJ13与TJ17站位聚成一组，TJ16、TJ23与TJ27站位聚成一组(图2)。主要营养盐含量的聚类结果，与站位距离具有较高的一致性，该结果表明在本文的研究范围内，渤海湾的海水水质随离岸距离呈现出梯度变化的趋势。
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