摘要目的：研究大蒜素对胃癌细胞SGC.7901生长的抑制及其机制。方法：应用MTr、RT—PCR及Westernblot等方法观察细胞形态、P38及Caspase一3蛋白及基因的表达情况。结果：(1)大蒜素抑制细胞生长、凋亡细胞增多(P<0.05)。(2)大蒜素作用下胃癌细胞p-P38、Caspase一3表达量增加(P<0.05)。结论：大蒜素能抑制胃癌细胞增殖.诱导凋亡。
关键词胃肿瘤;大蒜素;凋亡
胃癌在全球发病率高，死亡率在恶性肿瘤中居第二。五年生存率仍仅为7%～14%，因此寻找新的治疗靶点对于胃癌的防治具有重要的意义…。实验发现大蒜素通过直接杀伤肿瘤细胞及调节机体免疫功能两个方面干扰肿瘤细胞生长进而抑制肿瘤的发生[。本实验通过观察大蒜素对胃癌细胞株SGC一7901生长及凋亡的影响，探讨对胃癌生长抑制及促进其凋亡的可能作用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株及实验材料胃癌SGC.7901细胞株(中国科学院上海生命科学研究院);大蒜素(山东鲁抗辰欣药业有限公司);RPMI.1640(美国Gibco公司);Hoechst染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Trizol试剂盒(美国Gibco公司);逆转录试剂盒(日本Takara公司);兔抗人P—p38抗体(CellSignaling公司);兔抗人Caspase.3抗体(abeam公司);二抗(美国Bioworld公司)。
1.1.2引物根据Genebank资料库.应用premiers5.0软件设计和确定最优引物。然后经Blast匹对，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1细胞培养人胃癌细胞SGC.7901在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养.用0.25%胰蛋白酶消化传代，37℃、5%CO：、95%湿度条件下的培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2实验分组将细胞分为3组：(1)空白组;(2)对照组：含培养细胞，不加药物干预;(3)大蒜素作用组：含培养细胞，药物作用终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0~zg/mL亚组。以上每组均设4个平行孑L。
1.2.3MTT法测定细胞生长抑制率收集对数生长期的细胞.以10eells/~L的密度铺于96孔板，培养24h后，加入不同浓度，继续培养48h，弃去培养液，加入无血清培养液100L/孔，MTT20~L/：fL，培养4h后加人二甲基亚砜150L/孔，振荡10min，490nm波长测定吸收值。抑制率=(A对照组一A药物组)/a对照组×100%。绘制抑制曲线，计算药物半数抑制率(IC50)。
1.2.4Western.Blot检测蛋白，表达、RT.PCR检测基因表达细胞铺24孔板24h后，按设定浓度加入大蒜素，每一浓度组4孔。培养72h后移去上清，直接裂解、收集细胞。提取总蛋白，Westernblotting法检测p.P38MAPK、Caspase.3蛋白水平。以Tubulin作为内参AlphaEaseFC4.0图像分析软件进行分析。提取总RNA，RT—PCR检测P38MAPK、Caspase-3mRNA的表达水平。
1-3统计学分析采用SPSS16.0统计软件分析。计数资料用±S表示。两样本均数比较采用独立样本t检验。组间比较采用单因素方差分析。P<0.O5认为差异有统计学意义。
2结果
2.1大蒜素抑制胃癌细胞SGC.7901增殖MTT检测显示大蒜素能够显著抑制细胞增殖，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐增加，呈现浓度和时间依赖性。2.5～40.0~g/mL不同浓度大蒜素作用SGC.7901细胞株24h，对SGC.7901细胞的增殖抑制率从2.43%升高到67.38%。与对照组相比.除2.5~g/mL组差异无统计学意义(P>0.05)，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。作用48h，对细胞的增殖抑制率从4.42%升高到79.9l%。与对照组相比。各组差异均有统计学意义(P<0.05)。作用72h，细胞的增殖抑制率从7.23%升高到91.35%。与对照组相比，各组差异均有统计学意义(P<0.05)。而低浓度2.5p~g/mL大蒜素作用SGC一7901细胞株24、48、72h的抑制率从2.43%递增到7.23%：高浓度40.0~g/mL大蒜素作用SGC.7901细胞株24、48、72h的抑制率从67.38%递增到91.35%(表1)。
2.2细胞形态学观察光镜观察：对照组肿瘤细胞密度高，布满整个观察视野，细胞增殖旺盛，部分细胞因生长拥挤漂浮，细胞贴壁性好，胞浆丰富且分布均匀，胞核大、深染，核周有凹陷性切迹，核分裂像多见;随着药物作用浓度的提高(2.5～10.0p~g/mL)，细胞数量逐渐减少，贴壁性减弱，细胞质中颗粒增多，细胞透亮度降低，细胞之间间隙加大.细胞膜边缘毛糙;20.0、40.0~g/mL大蒜素作用72h后，细胞数量明显减少，密度减低，贴壁性差，大部分细胞漂浮、死亡，细胞形态变得不规则，细胞之间间隙加大，细胞质中空泡增多明显，细胞膜边缘毛糙明显，核浆比例下降，核分裂像少见。
2.3RT.PCR检测P38及Caspase.3mRNA表达情况不同浓度大蒜素作用于胃癌SGC一7901细胞72h后.以Trizol法提取细胞总RNA，进行RTPCR半定量检测，结果如图1，并对其进行半定量分析，基因半定量分析显示：2.5—4O.0~xg/mL不同浓度大蒜素作用SGC.7901细胞株72h后，其Caspase一3/GAPDH值从0.223升高到1.131，与对照组相比，差异具有显著性，不同浓度之间亦有显著性差异(P<0.01);P38/GAPDH值从0.252升高到0.881，与对照组相比差异具有显著性(P<0.01)。
可发现不同浓度大蒜素作用SGC一7901细胞株72h后。P38/GAPDH与Caspase一3/GAPDH比值均随着浓度增高而逐渐升高，与对照组相比，差异有统计学意义。由此可见：大蒜素作用于胃癌SGC一7901细胞可显著增强细胞中P38及Caspase.3mRNA的表达.并且随着药物浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性。
2.4WseternBlot检测p-P38及Caspase.3蛋白表达情况大蒜素以不同的浓度作用于胃癌SGC7901细胞72h后.对细胞进行Westernblot的检测.结果如图2所示用ImageJ软件对WesternBlot结果进行分析，并将所得数据通过SPSS16.0进行统计学分析.单因素方差分析结果显示，不同浓度大蒜素诱导下P—P38及Caspase一3蛋白表达量的相对值(与Tubulin的比值)随着大蒜素浓度的升高而升高(P<0.05)，与基因表达情况相似均呈现浓度依赖性
3讨论
经典的细胞凋亡信号传导通路有以下3条]：(1)死亡受体通路，以Fas/FasL通路为代表。(2)内质网通路。(3)线粒体通路，引起下游Caspase级联反应。以上3条通路最后均通过Caspase共同通路介导细胞凋亡。而Caspase一3作为Caspase家族成员功能相对较明确的凋亡效应分子，在细胞凋亡中发挥关键作用。P38MAPK信号传导通路是MAPK通路的分支之一，其在炎症、应激、凋亡、细胞周期和生长的多种生理和病理过程中发挥着重要作用l7_，而且可能是潜在的肿瘤治疗的靶目标有研究表明P38MAPK激活会导致Caspase一3表达增加从而促进凋亡[1o]。本实验通过观察不同浓度大蒜素对胃癌细胞生长及凋亡的影响，发现P38、Caspase.3mRNA及蛋白表达均随着大蒜素浓度增加而增加，大蒜素能够诱发胃癌细胞凋亡，随着作用浓度的增加或作用时间的延长.胃癌细胞凋亡增多。由此我们推断，大蒜素通过增加P38基因的表达，进而激活P38MAPK途径的信号表达，进而增加Caspase.3的表达，从而引起Caspase.3级联反应，抑制细胞生长，促进细胞凋亡。然而，究竟大蒜素是通过P38表达的增加调节Caspase.3表达的变化。亦或是直接调节P38及Caspase.3表达我们尚无法界定，因此在下一步实验中我们会对P38进行阻断，从而明确两者之间的联系。
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综上所述，本实验的研究结果表明，大蒜素能够抑制胃癌细胞SGC.7901的增殖，诱发凋亡，其机制与Caspase.3的表达增加相关。由此提示P38MAPK/Caspase.3途径在调控胃癌细胞凋亡方面的作用，从而为抗肿瘤治疗提供一个新的思路。但是大蒜素激活P38，进而激活Caspase途径的具体方式尚未深人探讨，还需进一步的研究
