[摘要]目的：观察胰高血糖素样肽一1(GLP一1)对大鼠心肌缺血再灌注/细胞缺氧复氧损伤的作用并探讨其机制。方法：建立大鼠缺血再灌注模型，分别设假手术组(sham)、缺血再灌注组(IR)和IR+GLP一1(0.030nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)组，缺血30min后再灌注3h，Evan'sblue—TYC法检测心肌梗死范围;取左心室游离壁心肌组织，TUNEL法检测心肌细胞凋亡，同时测定心肌组织中氧化一抗氧化物质超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;培养乳鼠心肌细胞，随机分为正常对照组(contro1)、单纯缺氧复氧组(HR)、HR+GLP一1(1~mol/L、5bcmol/L和10txmol/L)组，电镜下观察心肌细胞形态的变化，流式细胞术检测心肌细胞的凋亡，测定乳酸脱氢酶(LDH)释放、SOD活性、MDA含量、活性氧簇(ROS)水平以及线粒体膜电位(MMP)。结果：与IR组相比，IR+GLP一1(0.03nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmolfL)组剂量依赖性地减小心肌梗死面积，减轻线粒体超微结构改变及细胞凋亡，增加SOD活性，减少MDA含量(P<0.05或P<0.01);与HR组相比，HR+GLP一1(1t~mol/L、5I~mol/L和10p~moL/L)组剂量依赖性地逆转HR诱导的细胞损伤，增加SOD活性，减少MDA含量，降低ROS水平，减轻HR诱导的MMP降低(P<0.05或P<0.01)。结论：GLP一1可以减轻大鼠心肌缺血再灌注/细胞缺氧复氧损伤;其作用机制可能与增强心肌抗氧化能力及保护线粒体结构和功能有关。
[关键词]胰高血糖素样肽一1;缺血再灌注损伤;缺氧复氧;心肌细胞;抗氧化;线粒体膜电位
胰高血糖素样肽一l(glucagon—likepeptide一1，GLP一1)又称为肠促胰岛素、类胰升血糖素一1或胰升血糖素样肽一1。人们对GLP一1的研究多集中于它在糖尿病的发生、发展以及治疗领域的作用上，新近国外研究提出GLP一1对心肌损伤具有一定的保护作用。Nikolaidis等研究发现给予扩张性心肌病狗GLP一1后，心肌细胞对葡萄糖的摄取和左心室的收缩功能均有明显的改善。此外对心肌梗死病人给予GLP一1也可以改善患者的心功能以及血管成形术后严重的左心室收缩功能不良J。心肌缺血/再灌注损伤(myocardialischemia—reperfusioninjury，MIRI)是临床上最为常见的损伤心肌的病理生理过程之一_3J。但是目前国内关于GLP一1对心肌缺血再灌注损伤作用的研究还相对较少，其相关机制仍尚未阐明。
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本实验以在体大鼠和体外培养乳鼠心肌细胞为模型，观察GPL一1对心肌细胞损伤的影响，并初步探讨其作用机制，为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的线索和思路。
材料和方法
1主要仪器和试剂
健康雄性Sprague—Dawley(so)大鼠及1—3日龄SD乳鼠均由山西医科大学实验动物中心提供。胰高血糖素样肽一1(Sigma);兔抗鼠Ot一肌动蛋白I抗(北京博奥森);RBITC一羊抗兔Ⅱ抗(solarbio，Spain);超氧化物歧化酶(supemxidedismutase，SOD)测试盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinV—FITC/PI)双染色试剂盒(晶美生物工程有限公司);细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche);二氯荧光素二乙酯(DCF—DA，Sigma);线粒体膜电位检测试剂(Jc一1，凯基生物科技发展有限公司)。倒置显微镜(NikonTS100);动物人工呼吸机(成都泰盟科技有限公司，HX一100E);多道生理信号采集处理系统(RM6240BD，成都仪器厂);激光扫描共焦显微镜(OlympusFV1000);透射电镜(JEM—CX100)。
2缺血再灌注模型建立
戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定。记录Ⅱ导联心电图，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，经胸骨左缘第2—3肋间打开胸腔暴露心脏，于左心耳根部下方2mm处用5/o线结扎冠状动脉前降支，将丝线两端·859·穿过1根聚乙烯小管，止血钳夹持细管，结扎线以下心肌组织颜色变暗，在Ⅱ导联心电图见R波明显增大伴sT段即刻抬高，说明心肌已缺血。30min后予以再灌注，以缺血区转红，相关导联sT段明显回落为再通标志，并持续3h。
3乳鼠心肌细胞的培养
取1～3d龄SD大鼠，雌雄不限，开胸取心室肌作原代细胞培养，差速贴壁法分离纯化心肌细胞，48h后更换培养基。培养3—4d后，倒置显微镜下观察细胞自发搏动情况。针对胞浆中0【一actin，采用抗一actinI抗与FITC标记的荧光Ⅱ抗，免疫荧光法鉴定心肌细胞。
4心肌细胞缺氧/复氧模型的建立
采用Koyama等的方法，配制缺氧液和复氧液。缺氧液(NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO36.0mmol/L，CaC121.0mmol/L，MgSO41.2mmol/L，乳酸钠40mmol/L，HEPES20mmol/L，NaC198.5mmol/L，KC110.0mmol/L，pH6.8，37℃)，预先用高浓度氮气饱和(>99.9%，1L/min×30min)，测血气PO2≤4.0kPa;复氧液(NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO320mmol/L，CaC121.0mmol/L，MgSO41.2mmol/L，葡萄糖5.5mmol/L，HEPES20mmol/L，NaC1129.5mmol/L，KC15.0mmol/L，pH7.4，37oC)，预先用纯氧饱和(1L/rain×30min)。实验时弃去原培养液，用缺氧液漂洗细胞2次，换预先经高浓度N饱和的缺氧液，培养板置纯N持续通气的密闭容器中(37℃)3h，再换预先经纯氧饱和的复氧液，以纯0复氧孵育1h(37oC)。
5实验分组
实验动物随机分为5组，每组16只。假手术组：穿线但不行冠脉结扎;IR组：开胸结扎冠状动脉左前降支30min，松解结扎后再灌注3h;IR+GLP—l组：于缺血再灌注前30min经舌静脉缓慢注入GLP一1(0.03nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)，随后处理同IR。
乳鼠心肌细胞培养3d后，给予缺氧复氧处理，实验分为5组：正常对照组;HR组;HR+GLP一1(1~mol/L、5I~mol/L和10p,mol/L)组：GLP一1预孵育24h后给予缺氧复氧处理。
6心肌梗死面积的测定
大鼠经再灌注3h后再次原位结扎左冠状动脉，经颈动脉注入伊文氏蓝。取出心脏，切片，Trc染色，蓝色为未缺血区域、红色为缺血区域。将红色的缺血心肌片置于TTC磷酸缓冲液染色。缺血但未梗死心肌染成红色，梗死心肌则为灰白色，称量缺血未梗死心肌和梗死心肌湿重。心肌缺血范围=缺血心肌面积/左心室面积(areaatrisk/eftventriculararea，AAR/LV);心肌梗死范围=坏死区面积/危险区面积(necroticarea/areaatrisk，NEC/AAR)
7心肌超微结构观察
迅速取下心尖部心肌组织切成1mmx1mmx1mm，戊二醛磷酸盐缓冲液、钱酸各固定2h，脱水、包埋、切片、醋酸双氧铀、枸檬酸双重染色，透射电镜下观察心肌细胞超微结构。
8心肌细胞凋亡测定
采用TUNEL凋亡试剂盒检测各组心肌组织中的凋亡细胞，激光扫描共焦显微镜下观察，TUNEL阳性细胞核呈绿色荧光。
9流式细胞仪检测心室肌细胞的凋亡率0.125%胰蛋白酶制备单细胞悬液，用AnnexinV-FTTC/P双染色标记法进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。
10心肌氧化、抗氧化物质检测
再灌注3h结束后取左心室前壁心肌组织，-70℃冰箱冻存，制备组织匀浆，按试剂盒说明书操作检测SOD活性和MDA含量。复氧1h后收集各组心室肌细胞培养液，按照乳酸脱氢酶(lactatedehy-drogenase，LDH)，MDA，SOD试剂盒的操作说明测定各实验组心肌细胞培养液中LDH，MDA的含量及SOD活性。
11细胞内ROS含量检测
心肌细胞内ROS产生水平通过使用ROS敏感的荧光探针DCF-DA测定。细胞爬片，给予相应处理后，DCF-DA染液37℃孵育30min，荧光显微镜下随机采集5个不重复区。用Image」软件进行荧光强度分析。
12线粒体膜电位检测
收集细胞，加入JC-1溶液(10mg/L)，37℃，5%
co，培养箱孵育15min，清洗，重悬细胞，在荧光显微镜下观察，正常细胞线粒体发射红色荧光，同一滤光镜下呈橙色，细胞凋亡时红色荧光强度减弱，绿色荧光增强，同一滤光镜下呈绿色。图像结果用Image」软件分析计算绿色和红色荧光强度平均值，绿色与红色荧光强度的比值代表心肌细胞去极化程度。
13统计学处理
用SPSS12.0统计软件进行分析，数据以均数标准差(xts)表示，数据分析采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。结果
1心肌梗死面积
假手术组心肌缺血范围为0，IR组与GLP-1+
IR组AAR/LV差异无显著(P>0.05)，说明实验操作手法基本一致，排除了由此而造成的误差。与IR组此较，IR+GLP-1组NEC/AAR明显下降(P<0.
05)，见表1。
2心肌细胞超微结构观察
假手术组线粒体沿肌丝长轴排列整齐，外膜完整，暗密集，基质致密，内有电子致密颗粒。胞核呈椭园形，异染色质分布均匀。IR组出现广泛的线粒体损伤，表现为线粒体肿胀，基质明显变淡，嵴排列紊乱。核皱缩，染色质凝集。GLP-1预处理组除部分区域线粒体有改变外，与对照无明显区别，见图1.
