摘要：目的观察姜黄素对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响，并探讨血红素氧合酶一1(HO一1)在姜黄素抑制血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制。方法体外分离培养大鼠血管平滑肌细胞并行免疫组化鉴定，以四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖率、逆转录一聚合酶链式反应(RTPCR)检测HO一1mRNA水平，蛋白免疫印迹法(Westernblot)分别检测HO-1及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达水平。结果0IDL呈浓度依赖性(0～150“g/mL)地诱导VSMC增殖，达到200/~g/mL具有细胞毒性;姜黄素呈浓度依赖性(40、80~mol/L)地抑制Ox-LDL(100“g/mL)所诱导的VSMC增殖，HO-1抑制剂锌原卟啉IX(ZnPPIX)可明显减弱此抑制效应;姜黄素可诱导VSMC上调HO-1mRNA和蛋白表达;姜黄素可减弱Ox-LDL诱导VsMcs增殖细胞核抗原的高表达，此效应可被H0—1抑制剂ZnPPIX抑制。结论姜黄素通过降低HO-1介导的PCNA表达，进而抑制0LDL诱导大鼠血管平滑肌增殖。
关键词：姜黄素;氧合酶类;脂蛋白类，LDL
动脉样硬化(atherosclerosis，AS)的发生机制十/寸复杂，q前研究表明氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipo—protein，Ox-LDL)及血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VsMc)增殖是动脉粥样硬化斑块形成的重要病理基础¨1J。姜黄素是从姜黄、郁金、莪术等植物中提取的一种生物多酚化合物，研究显示姜黄素具有抗炎、抗氧化、促细胞凋亡和抑制细胞增殖等药理作用，这些作用可有效拮抗AS的发生与发展。血红素氧合酶一l(hemeoxygenase一1，HO-1)是血红素降解的起始酶和限速酶，发挥着抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡和改善组织微循环作用，动物研究已经证明过表达HO-1可以明显延缓As进展|2]，但是姜黄素抗AS的相关机制还不甚清楚。本研究旨在于细胞水平探讨姜黄素对Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的影响及其相关机制，为其药理作用提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibico公司;姜黄素、锌原卟啉IX(zineprotoporphyrinⅨ，zn—PPIX)购自Sigma公司;Ox-LDL购于北京普博斯生物科技有限公司;反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)试剂均购自美国1n一vitrogen公司;一抗、二抗均购于美国SantaCruz公司;SD大鼠购自南方医科大学实验动物中心;其余实验相关产品购自碧云天生物技术公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养与实验分组按常规组织贴块方法_3原代培养并传代，取用第3～8代细胞。免疫组化法鉴定血管平滑肌细胞。血管平滑肌细胞用含1O%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5C02下培养。实验分组：(1)正常对照组：不加任何处理;(2)不同终浓度Ox-LDL刺激组(0、50、100、150、200、250/~g/mL);(3)不同终浓度姜黄素组(O、2o、4O、80ttmol/L);(4)不同终浓度姜黄素组(0、20、40、80/~mol/L)+Ox-LDL(100/~g/mL)组;(5)Ox-LDL(100/,g/mL)+姜黄素组;(6)姜黄素+ZnPPlX+Ox-IDL(100“g/mI)组。
1.2.2反转录聚合酶链反应检测H0—1mRNA按Trizol试剂盒说明提取总RNA。取细胞RNA1“L根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。HO-1：上游5GGGT—GACAGAAGAGGCTAAGACC3，下游5AGATTCTC—CCCTGCAGAGAGAAG3。扩增条件：94℃变性30s，56℃退火30S，72℃延伸45S，循环3o次。电泳条带采用凝胶成像系统分析。
1.2.3四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法比色测定VSMC增殖率VSMC接种96孔培养板中(每孔1×10个细胞)孵育24h，换无血清DMEM培养基24h后弃培养液，按实验分组加入药物。2Oh后加入5mg/mIMTT1OL，孵育4h，终止反应。弃孔内培养液上清液加二甲基亚砜100”L，选择492nm自动酶标光度计测定各孔吸光度值。细胞增殖率计算公式：细胞增殖率(cellviability)一处理孔AⅢ/x~照孑LA492×100。
1.2.4蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测HO-1及增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)蛋白表达水平收集细胞并加入细胞裂解液裂解细胞，离心收集上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)法测蛋白浓度。蛋白(30“g)经12十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectroDheresis，SDPAGE)分离后转移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidenedifluo—ride，PVDF)膜。5牛血清清蛋白室温封闭4h，加入一抗4℃过夜、二抗室温孵育2h，最后显像。1.3统计学处理数据均采用i±S表示，采用单因素方差分析，总体有差异两两比较采用最小显著差数法。采用SPSS13.0软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠血管平滑肌细胞鉴定培养的第3代细胞经免疫细胞化学检测，特异性的a—actin在免疫细胞化学染色后，胞浆着色，呈阳性反应，在镜下可见胞浆内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌肌动蛋白，见封3图1。
2.2Ox-LDL对诱导大鼠血管平滑肌细胞(VsMC)增殖的影响Ox-LDL呈浓度依赖性(0～150/,g/mL)地诱导VSMC增殖，但是当达到200>g/mi刺激组时，细胞数目减少，提示到达此浓度可能具备细胞毒性。各个浓度刺激组与空白对照组相比，细胞增殖显著，差异具有统计学意义
2.3姜黄素对Ox-IDL刺激的VSMCs增殖的影响不同终浓度的姜黄素(40、80/lmol/I)可明显抑制Ox—LDL(100g/mL)诱导的细胞增殖效应，且呈浓度依赖性;姜黄素(40、80“mot/L)+Ox-IDL组与Ox-LDI单独作用组相比，细胞增殖率显著降低，差异具有统计学意义(P
2.4HO一1抑制剂ZnPPIX对姜黄素抑制Ox-IDL所诱导的VSMC增殖的影响给予HO1抑制剂ZnPPⅨ预处理细胞后，姜黄素抑制OxLDI所诱导的VSMCs增殖效应减弱;姜黄素+ZnPPIX+Ox-IDI组与姜黄素+Ox-LDI组相比，细胞增殖率增加明显(P<0.05)，见图4。
2.5姜黄素对VSMC的HO一1表达的影响不同浓度姜黄素组干预VSMC的H(YlruRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组，实验重复3次，见封4图5。2.6姜黄素对Ox-LDL刺激VSMC的PCNA表达的影响相比较于空白对照组，O~LDL可明显增强PCNA的表达;而姜黄素+Ox-LDI组与Ox-IDL组单独作用比较，可明显抑制PCNA的表达;在加入HO1抑制剂ZnPPⅨ后，姜黄素+OxLDL组的抑制PCNA表达效应可被减弱，实验重复3次，见封4图6。
3讨论
平滑肌细胞增殖是AS斑块形成过程中的重要环节，大量研究表明动脉血管壁增厚至斑块形成是AS病变的主要病理特征。Ox-LDL促进AS形成的作用已被大量的研究所证实。目前认为AS形成初期步骤是LDI进入内皮损伤部位的血管壁，氧化、诱导多种趋化因子，并激活单核细胞分泌不同的生长因子和细胞因子，刺激平滑肌细胞迁移、增殖。因此，Ox—IDL在AS中起到关键作用。
HO—l是血红素降解的起始酶和限速酶，HOl通过降解血红素产生一氧化碳(carbonmonoxide，CO)、胆绿素和铁离子。胆绿素进一步经胆绿素还原酶作用生成胆红素，而铁离子能诱导铁蛋白的合成_4]。HO一1的这些终产物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗血栓的作用;另外，CO和胆色素通过影响血管平滑肌细胞、内皮细胞、内皮祖细胞和粒细胞的增殖、迁移和黏附保护受损动脉血管内平衡E53。姜黄素是中药姜黄的主要成分，其抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血栓以及心血管的保护作用已经被证实l6]。目前已经有研究表明姜黄素具有抗细胞增殖的作用，但是具体机制还不甚清楚_8_。根据其众多药理作用与HO一1保护作用相似，姜黄素的相关保护作用是否经过HO-1介导值得研究。
本研究结果显示，Ox-LDL在一定浓度范围内浓度依赖性地诱导血管平滑肌细胞增殖，当超过一定浓度，具备细胞毒性。此实验发现与Chang等l9的研究结果相类似，说明了OX-LDL对血管平滑肌细胞增殖影响的特点，其机制可能是通过激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路促进细胞有丝分裂[1。与之类似，Schwer等[1l_也发现姜黄素HO-1介导抑制胰腺星状细胞的增殖由阻遏ERK1/2磷酸化的机制实现。同时，本组也发现姜黄素可有效抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖，并且此抑制效应可被HO-1的抑制剂ZnPPⅨ部分阻断。这提示HO—l很可能参与了姜黄素抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的保护效应。同样，有学者发现在球囊损伤的大鼠模型中，H0—1介导N0抑制大鼠血管平滑肌增殖，从而显著地抑制了内膜增生¨1。为了进一步证实此发现，本组观察了姜黄素对血管平滑肌细胞H0—1mRNA和蛋白表达的影响，发现姜黄素可显著地上调血管平滑肌细胞HO一1mRNA和蛋白表达。综上所得出的实验结果，提示姜黄素抗Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的作用经过HO-1介导。
PCNA又称周期蛋白，是一种与细胞增殖周期有关的核内糖蛋白，是DNA复制的必需成分，其表达与细胞增殖活性有关，是使细胞由静息期进入s期的关键蛋白D33，已成为评价细胞增殖状态的一项客观指标。本组研究发现HO一1抑制剂上调姜黄素抑制Ox-LDL诱导VSMCs增殖细胞核抗原高表达，提示HO-1介导的抑制增殖的效应可能部分通过抑制PCNA表达实现。另外研究发现HO-1的抗增殖效应通过上调细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21_1，P21是细胞周期素蛋白cdk一2抑制蛋白，cdk_2亦是细胞周期G和s期调节关键。Liu等[15]以含HO一1基因的重组腺病毒转染大鼠主动脉平滑肌细胞，被转染的大鼠主动脉平滑肌细胞以剂量依赖方式表达HO一1mRNA、HO-1蛋白和提高酶的活性，刺激促凋亡基因p53表达，促进VSMCs凋亡而抑制血清刺激的VSMCs增殖。
综上所述，姜黄素显著地抑制Ox-LDL诱导的大鼠VSMC增殖，其机制是由H(9-1介导的PCNA表达下调实现的。这为进一步研究姜黄素防治AS提供了一定的理论依掂。
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