摘要目的：研究肾含钙结晶盐形成与维生素D受体(VDR)基因启动子FokI位点单核苷酸多态性(SNP)之间的关系。方法：根据超声检查进行分组：8O例肾皮质含钙结晶盐形成患者(A组)及8O例无结晶盐形成者(B组)。应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR.RFLP)对两组进行FokI多态性检测。分析两组间基因型和等位基因的分布情况。结果：A组基因型分布FF：30%(24/80)。Ff：50%(40/80)，f：20%(16/80);B组FF：34%(27/80)，Ff：60%(48/80)，f：6%(5/80);其中ff分布在两组中差异有统计学意义(P<0.05)。A、B两组F等位基因频率分布分别为55%(88/160)和64%(102/160);f分别为45%(72/160)和36%(58/160)，差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论：VDR基因起始密码子中FokI多态性与肾皮质含钙结晶盐形成有关系，超声作为一种无创简便的早期诊断方法在本研究中有着较重要的作用。
关键词维生素D;受体;超声检查;多态性;结晶盐;肾
含钙结晶盐的形成可能是导致泌尿系统结石发生的重要条件之一，维生素D受体(vitaminDreceptor，VDR)在钙的代谢中起着重要的作用[。VDR基因启动子上存在有FokI位点单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。该SNP对尿钙浓度有一定的影响E2]。超声是一种无创、简便经济的早期诊断肾结晶盐的方法，我们通过超声检测肾皮质含钙结晶盐的形成，并分析结晶盐与VDR基因启动子SNP的关系，为研究泌尿系结石发生的原因提供一定的参考。
1对象与方法
1.1研究对象收集2009年8月至2011年3月在本科检查的肾皮质含钙结晶盐患者80例作为观察组(A组)，其中男52例，女28例，双侧10例，单侧70例，年龄23～57岁，平均(37.09±9.07)岁。同时收集8O例无肾实质结晶盐形成者作为对照组(B组)，其中男58例，女22例，年龄21～56岁，平均(38.78-4-8.89)岁。两组均无泌尿系统感染。排除泌尿系肿瘤及尿路梗阻，两组年龄性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准。参试者均签署知情同意书。
1.2方法与仪器
1.2.1肾皮质含钙结晶盐的检查两组人群均行常规泌尿系统超声检查。超声诊断仪机型为SIEMENS.Antares、ALOKA5000.探头频率3—6MHz.受检者取仰卧位及侧卧位。经侧腰部行冠状切面观察肾皮质结晶盐.有需要时经背部行肾纵切面扫查，也可嘱患者深吸气.沿12肋骨下缘扫查显示受肋骨遮挡部肾脏。结晶盐超声诊断为肾皮质内强回声无声影及后方伴不同程度彗星尾征，并排除部分弓形动脉钙化、肾钙乳囊肿、肾实质小囊肿、肾钙质沉着等容易混淆的异常声像图，由两位高年资超声科医师做出判断。
1.2.2DNA的提取抽取实验对象肘静脉血2mL，经EDTA抗凝.采用TIANampGenomicDNAKit试剂盒(深圳晶美)提取基因组。
1.2.3PCR扩增通过GenBank检索到VDR基因序列『gi：29745161]，Genefisher设计引物：上游5ACTGACTCTGGCTCTGAC3：下游5CACCTTGCTFCTFCTCCC3，引物合成由深圳晶美公司完成。扩增VDR包含起始密码FokI的DNA片段，预期产物片段246bp。PCR反应体系：反应总体积为50L，含2L模板DNA，8L上、下游引物，2LdNTPs，0.7LTaqDNA聚合酶和相应的缓冲液。反应条件为：预变性96~C8min.94℃45S.52℃146360s，72℃30s，共4O个循环。72℃延伸10min。
1.2.4PCR。RFLP分析多态性对起始密码多态位进行PCR扩增后，取10PCR产物加入限制性内切酶FokI(深圳晶美)0.5L及10×buffer1L，牛血清白蛋白1L，DNA7.5L，总反应体系20，37℃酶切，2%的琼脂糖凝胶对酶切产物电泳，自动凝胶成像仪成像，检测基因型。
1.3统计学方法采用SPSS17.0分析软件进行统计分析。组间VDR基因型分布(计数资料)概率比较采用)(检验。
2结果
2.1肾皮质含钙结晶盐超声影像图见图1。
2.2基因型的PCR.RFLP分析见图2。
2.3VDR基因FokI多态性以及等位基因在两组中的分布ff基因型在两组问的分布差异有统计学意义(P<0.05)，而FF和FT基因在两组间分布的差异无统计学意义(P>0.05)。F以及f基因频率两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
3讨论
泌尿系结石形成机制目前尚不明确.绝大多数结石成分中都含有钙。所以高钙尿是含钙结石形成的重要原因之一[。孙建涛等[]通过动物实验研究发现，高草酸尿可导致肾小管内草酸盐结晶沉积，合并梗阻后，会造出沉积加重。卢少明等_6]发现雄性激素会导致雄鼠内肾结晶盐的形成，当结晶盐沉积于肾脏，声像图即可表现异常，主要在肾皮质集合管沉积，随着病程进一步发展，肾髓质或乳头处出现尿酸盐结晶。多数结晶盐特点是x线不显影[.超声可以显示不透光的结晶盐及结石.原发性肾结石形成过程中。在不存在梗阻的条件下，含钙结晶盐的形成可能在肾实质。超声检查作为一种无创，方便，经济的检查方式，相比x线检查具有无射线，敏感性高等优势。
目前已经发现的VDR基因上存在的基因多态性位点有BsmI、TaqI、FokI等位点，其中FokI位于启动子上E8-9]，启动子结构的改变对基因的表达会产生重要的调节作用，进而影响VDR的生物学功能。目前较多文献研究饮食因素与肾实质内含钙结晶盐形成的相关性，王军等[-o]研究发现，苏子油可以使肾草酸钙结晶形成明显减少。已有研究分析VDR基因多态性与尿钙浓度有一定的相关性…]。但VDR的基因改变是否影响肾实质中含钙结晶盐的形成，有无相关性，目前尚无相关研究。
本研究运用超声检测早期肾皮质结晶盐的形成.并通过PCR—RFLP方法检测VDR基因启动子上存在的FokI基因SNP。分析其与。肾皮质含钙结晶盐形成的关系。我们发现观察组中ff基因型例数明显高于对照组，说明ff基因型与肾皮质含钙结晶盐的形成有一定的相关性，携带ff基因型人群较其他两类基因人群可能更容易发生肾皮质含实用医学杂志2012年第28卷第9期钙结晶盐的形成。
本实验结果表明VDR基因启动子上存在的FokISNP与人体的肾皮质含钙结晶盐形成之间存在一定关系，ff基因型可以作为导致结晶盐形成的基因标记物之一，肾皮质含钙结晶盐是否最终发展为结石，尚有待进一步研究。超声作为一种无创方便的检查手段可以作为肾结石早期诊断和追踪的方法并为结石二级预防提供重要的参考信息。
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