[摘 要] 目的：比较膝骨关节炎患者与正常人血清蛋白质组的差异 ，筛选其能用于骨关节炎诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标志物。方法：利用双向荧光差异凝胶电泳技术比较膝骨关节炎患者血清(4例)与健康志愿者血清(4例)蛋白图谱的差异，使用基质辅助激光解吸电离 一飞行时间质谱及生物信息学相关技术对获得的差异蛋白进行鉴定和初步分析，并用 Westernblotting进一步验证所鉴定的蛋白。结果：成功建立了骨关节炎血清差异蛋白质组学的研究方法;通过质谱分析初步鉴定出 8个差异蛋白，其中5个蛋白在膝骨关节炎组表达上调， 3个蛋 白在膝骨关节炎组表达下 调。Western blotting进一步验证 得到 仪 一巨球蛋 白在膝骨 关节 炎组表 达上调 ，与双向荧光胶内差异凝胶电泳技术联合质谱分析的结果一致。结论 ：膝骨关节炎患者血清与正常人血清蛋 白表达存在明显差异，其中仅：一巨球蛋白可作为骨关节炎潜在的疾病相关生物学标志物进一步研究，为骨关节炎的诊断、治疗和发病机制的研究提供新的线索和实验基础。
[关键词] 骨关节炎 ;血清;生物学标记物;双向荧光差异凝胶电泳
骨关节炎 (osteoarthritis，OA)是由于机械和生物性因素共同作用所 导致 的关节 软骨细胞 、细胞 外基质 、软骨下骨合成 和降解 动态失衡所致 的全关节疾病…。OA以中老年患者多见 ，且女性 多于男性 ，60 岁 以上人 群患病率 可达 50% ，75岁 以上人 群则 达 80% ，该病的致残率可高达 53% ，好发 于负重大 、活动多的关节 ，如膝 、脊柱 、髋 、踝 、手等关节-2J。发展到中晚期的 OA往往需要手术来减轻疼痛 、矫正畸形和改善关节功能 ，但手术不仅 给患者带来沉重 的经济负担 ，也不能很好地解 决关节 软骨的修复 和重建问题。然而 OA的发病机制 目前 尚不明确 ，缺乏有效的生物学标 志物及早期诊断 和治疗 的方法 ，因此采取新 的方法和手段 阐明 OA的发病机制 ，发现新的疾病诊断标志物对提高 OA患者的生活质量有重要意义。蛋 白质组学是后基 因组时代 的一 门新兴科 学 ，是对生物体在蛋 白质水平上定量、动态 、整体性 的研究 ，同时也能 为阐明众多疾病 的发病机 制提供理论根据和解决途径。本研究采用双 向荧光差异凝胶电泳 (two—dimensionalfluorescencedifferencegelelec— trophoresis，2D—DIGE)联合基质辅助激光解吸电离一 飞行 时 间质 谱 (matrix—assistedlaserdesorption ionization time一0f—flightmass spectrometry. MALDI — TOF—MS)，成功建立了 OA血清差异蛋 白质组学的研究方法 ，通过对筛选 出的差异蛋 白的进一 步研究 ，为发现新的诊断标记物和药物治疗靶点 ，以及发病机制的研究提供重要线索。
材 料 和 方 法
1 材 料和 仪器
1.1 主要试剂 十二烷基硫酸钠 、二 硫苏糖醇 、过硫酸铵 、丙烯酰胺 、N，N’～亚甲基丙烯酰胺 、四甲基乙二胺 、甘氨酸等均购 自 Sigma;去血清高峰度蛋 白试剂盒 ProteoExtractAlbumin/IgG RemovalKit购 自 Merck;蛋白质纯化试剂盒 Clean—upKit、蛋 白定量试剂盒 2DQuantKit、荧光标记试 剂盒 CyDyeDIGE FluorLabelingKit、固相 pH值于胶条、IPGbuffer等均购 自 GE， 2一巨球 蛋 白 (仅2一macroglobulin，仅2M; ab36995)I抗购 自Abcam，I1抗购 自Jackson。
1.2 主要仪 器和设备 IPGphor等 电聚焦仪、Ettan DALTsix垂直电泳系统、Typhoon9400型多功能激光扫描仪、DIGE分析软件 DeCyder6.0和全 自动斑点工作站 EttanSpotHandingWorkstation均为 GE产品，质谱仪 UltraflexIII为布鲁克产品;电泳凝胶成像分析系统 Tanon一2500为上海天能科技有限公司产品。
2 方法
2.1 实验对 象 从 中山大学 附属第三 医院骨科住院治疗的 30例诊断 明确膝骨关节炎 患者 中随机抽取 4例组成本研究 的 OA实验组 ，并根据实验组挑选年龄 、性别 和体重指数 (bodymassindex，BMI)分别对应匹配的 4例健康 志愿者组成本研究 的对 照组 。本实验标本的获取均 已征得入组 人员 的同意 ，符合相关卫生部门的伦理委员会原则 。
实验组需满足的条件 ：(1)诊断明确的骨关节炎患者 ：临床 诊 断 参 照 2007年 《骨 关 节 炎 诊 疗 指南》 ;(2)无类风湿性关节炎等结缔组织病 ;(3)无肝肾功能不 良，免疫系统疾病 ;(4)抽血前 1周 内未曾使用过非甾体类镇痛药 、糖皮质激素等 ;(5)无药 · 885 · 物过敏史 ;(6)非孕妇 、哺乳期 、月经期妇 女;(7)既往无关节感染 、结核 、关节创伤手术史。对照组需满足的条件 ：无包括骨关节炎在 内的关节疾病 的现病史和既往史 。
2.2 样品 实验前处理 所有血 清样本取清晨空腹静脉血 3mL，室温下静置 1h，4oC、2500×g离心 15 min取上清 ，用 0.2mLEP管 分装 ，一80℃保 存备用 。集 齐血清样本后 ，用 ProteoExtractAlbumin/IgG RemovalKit试剂盒去 除高丰度蛋 白，然后对样本进行纯化和定量 ，随后按荧 光标 记试 剂盒说明书对蛋白样品进行 CyDye荧光标记。2D—DIGE的实验设计为 ：从正常对 照组 N1～N4和 OA实验组 A1～A4 8个血清样本 中各取 25 g蛋 白共 200Ixg进行 cy2 荧光标记 ，作为 内参照(消除胶与胶之间的差异);取 N1、N2、A3、A44个血清样本各 50 g蛋 白进行 Cy3 荧光标记 ;取 A1、A2、N3、N44个血清样本各 50 g 蛋 白进行 Cy5荧光标记 (交叉标记 以消除不 同荧光染色效率不 同的误差 )。50fxgCy2标记的内参照、 Cy3标记 的 N1和 cy5标记 的 A1混合后进行双 向电泳分离 ，命名为胶 1;同理 ，内参 照、N2和 A2混合后为胶 2，内参照、A3和 N3混合后为胶 3，内参照 、A4 和 N4混合后为胶 4。
2.3 2D—DIGE双 向电泳 选择 pH4～7、24cm 的 IPG胶条对 血 清样 品蛋 白质 进行 第一 向等 电聚焦 (isoelectricfocusing，IEF);IEF参数 设置 为 ：30V、6 h;60 V、6 h;200 V、1 h;500 V、2 h;1000 V、2 h; 3 500 V、2.5 h;10 000 V、1 h;10 000 V、8 h;500 V、 12h;78350VHr收胶 。IEF完成后 ，在平衡缓 冲液中平衡胶条 ，将其转移至 12.5% SDS—PAGE胶上进行第二向电泳 ，电泳参数设置 为 ：第一步蛋 白转移： 2W/gel，电 泳 时 间 50min;第 二 步 垂 直 电 泳 ：17 W/gel，电泳直至溴酚蓝跑出凝胶下缘 10min(注 ：2D — DIGE凝胶的电泳在避光条件下进行)。
2.4 图像采集与分析 用 Typhoon9400型多功能激光扫描仪凝胶蛋 白图像 ，使 用 ImageQuant软件收集凝胶蛋 白图像 ，使用 DeCyder6.0软件对凝胶蛋 白图谱进行分析 ，选取蛋白丰度差异 >1.2倍的蛋 白质斑点 、t检验 P<0.05的斑点作进一步分析。 2.5 差异蛋 白点质谱 图的获取及质谱数据 的分析在 SpotHandlingWorkstation中切取差异蛋白点 ，将切取的蛋 白点进一步酶解 ，使用 Bruker的 UltraflexIII 质谱仪对酶解样品进行 MALDI—TOF—MS分析，获得样 品的肽 质量 指纹 图谱 (peptidemassfigerprinting， PMF)。所获得图谱使用 Biotools软件检索 ，以 Mascot (http：//www.matrixscience.com)为搜索引擎在数据库Swiss-Pro/Uniprot(http://www.expasy.c/sprol/)中检索，检索种属为human
2.6 Westem bloting分析 取30u血清样品蛋白，10%聚丙烯酰胶凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)后转印至槳偏氣乙烯(PVDF)膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭该膜37 ℃ 1 h，冲洗后加人1抗稀释液(稀释度1：2000)4℃孵育过夜后，再加人相应的1抗稀释液37℃孵有1h，经ECL显影后，用电泳凝胶成像分析系统分析灰度值。
3统计学处理
数据以均数士标准差(x±s)表示，采用软件SPSS 13.0进行统计学分析，均数比较采用独立样本1检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1 2D-DIGE图像采集及蛋白表达
依照2D-DIGE实验设计，依次进行实验样品的CyDye荧光染色、第一向IEF电泳、第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和2D-DIGE凝胶的扫描，得到分别由Cy2.Cy3和Cy5标记的不同血清蛋白样品的蛋白斑点图和不同荧光叠置所得的胶内差异图像，按实验设计进行电泳所得的4张2D-DIGE凝胶的荧光叠置图像，各胶检测到的蛋白斑点别为1567、1587，1583和1675，实验各胶的匹配率达71%。经DeCyder软件分析两组间蛋白丰度差异大于1.2倍，且具有统计学意义的点共有14个，其中有9个蛋白点在0A实验组表达上调，它们在胶上的编号为：318，536，546，757、769.773，912916和9175;5个蛋白点在OA实验组表达下调，它们在胶上的编号为：657，974、1196和1221，差异蛋白点在2D-DIGE凝胶上的具体位置，见图1。
2质谱鉴定联合数据库匹配分析结果
进行MALDI-TOF-MS鉴定的14个斑点均获得了较好的图谱，这些图谱以Mascot(hp:/wwww.matrixscience，com)为搜索引擎，联合检索数据库Siss Po/Uniprot(htp://ww.epasy.ch/spro/)初步鉴定出0A实验组与对照组间蛋白丰度差异大于1.2倍且有统计学意义的点共8个，其中有5个蛋白在OA组表达上调，3个蛋白在OA组表达下调，见表1，双向电泳能根据分子量和等电点对蛋白质进行二维分离，蛋白质经过磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰后等电点和分子量与原始状态相比会出现偏差，在双向电泳图谱上表现为在不同位置出现的蛋白斑点。例如本研究中a2-macroglobulin分别在5个位置出现，inter-alpha-trypsin inhibitor heay chain 4和 kininogen-1分别在2个位置出现，但经质谱鉴定均为同一种蛋白。
3 Western blotting实验结果我们进一步采用临床样本进行了Western blot-ting验证，结果表明，OA患者血清中a，M明显高于正常对照，见图2
讨论
随着全球向老龄化社会的发展，OA已成为中老年人慢性残障最常见的原因之一。有研究结果统计显示，在所有导致老年残障的疾病中，单纯的膝骨关节炎的致残率仅次于心血管疾病，处于第2位"，给家庭和社会带来沉重的负担。但对于骨关节炎的预防、早期诊断及治疗目前仍缺乏高效的方法。因此，对于骨关节炎，尤其是对膝骨关节炎等大骨关节关节炎的预防、早期诊断、早期治疗及发病机制的深入研究具有重大意义，关于这方面的研究也越来越受到我国乃至全球医疗机构和科研机构的重视。目前，关于0A的研究大多数以涉及OA病理改变的软骨、滑膜为中心而展开的，实验主要针对这些组织中的一种或几种因素与0A的关系，而且是基于某种假定成立的预期理论进行的，这些研究的目的也是为了证实或者否定这些假定的理论。然而，蛋白质组学这一高通量、高敏感性和高精确度研究方法的出现，打破了传统研究手段的限制，利用蛋白质组学技术可同时检测不同样品不同状态下成千上万的蛋白，这一技术的出现有利于新的蛋白生物学标志物、新药物治疗靶点及新作用机制的发现。目前，我国已有不少研究将蛋白组学的相关技术应用于各种疾病诊断及治疗的研究中，如梁琼等[等利用蛋白组学这一高通量、高敏感性和高精确度研究方法的出现，打破了传统研究手段的限制，利用蛋白质组学技术可同时检测不同样品不同状态下成千上万的蛋白，这一技术的出现有利于新的蛋白生物学标志物、新药物治疗靶点及新作用机制的发现。目前，我国已有不少研究将蛋白组学的相关技术应用于各种疾病诊断及治疗的研究中，如梁琼等1等利用蛋白组学技术寻找骨肉瘤恶性生物学行为的分子标记物;张晓雪等(3利用蛋白组学技术筛选类风湿关节炎患者血清特异性标志物;而胡志成等6则利用蛋白组学技术寻找病理性瘢痕形成机制中的特异蛋白为病理性瘢痕形成机制提供了新的思路。同时国内外也有不少研究将蛋白组学技术应用于OA的相关研究中，但大多数研究不约而同地选择了涉及OA病理改变的软骨、滑膜、关节液作为研究对象，多数理论也认为OA是关节软骨的局部病变。但是，目前仍没有任何一种关于0A的发病机制的假设理论经研究证实是一定成立的。因此，本研究突破以往研究思路的限制，选择血清蛋白作为研究对象，期望能通过对OA血清蛋白质组学的比较分析，为OA发病机制的研究提供新的思路和实验基础，寻找新的0A疾病相关蛋白，筛选出能用于OA诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标记物。
本研究采用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS的比较蛋白组学研究方法，成功建立了0A患者血清双向荧光胶内差异凝胶电泳技术体系，获得了分离效果良好、清晰的蛋白斑点图谱，每张胶均检测到数以干计的蛋白点，且胶与胶之间的蛋白斑点匹配率较高，通过Decyder软件找到了0A患者血清中8个具有显著差异表达的蛋白点，成功建立了0A血清差异蛋白组学的研究方法，为寻找OA血清生物标记物和OA疾病相关蛋白质的研究提供了实验基础。
经生物信息学检索显示，本研究所鉴定的在0A患者血清中差异表达的8个蛋白均直接或间接地参与机体的炎症反应、细胞凋亡、自身免疫反应，提示骨关节炎的发病机制与机体的炎症反应、细胞凋亡及自身免疫反应有着密切的关系。而通过对其它应用蛋白组学进行的OA相关研究的文献与本研究比较发现，a，M极有可能为0A的早期诊断提供新的生物学标记物，为OA的早期治疗提供新的药物治疗靶点，同时也为OA发病机制的研究提供了新的线索，然而其具体应用价值尚需大量的后续实验研究工作。
a，M是由肝脏内皮细胞分泌的广谱蛋白酶抑制剂，主要存在于血浆中，参与机体的免疫反应过程-1，为IL-1/LL-8TNF等炎症因子提供结合位点，有研究表明其与阿尔茨海默病的发病有关19-11。
虽然骨关节炎的发病机制目前尚不明确，但大多数研究发现骨关节炎的发生主要是由软骨细胞外基质胶原和聚集蛋白聚糖的丢失引起的"1。软骨聚集蛋白是由ADAMTS-4/5，ADAMTS-7/12等聚集蛋白聚糖酶降解，ADAMTS-4/5的抑制剂对软骨蛋白聚糖的分解和代谢起调节作用，任何情况的抑制阻断将会加速软骨聚集蛋白聚糖的降解，之前TMP一 3是 唯一一个被发现 的 ADAMTS一4/5内源性 抑制剂 ，目前研究发现 otM是另一个抑制剂u 。另有研究证明，仅2M是一个新 发现 ADAMTS一7/12的底物 ，两者结合可抑制 ADAMTS一7/12对 COMP的降解 ，同时 M也是一种重要 的基质金属蛋 白酶(m8. trixmetalloproteinases，MMPs)清除剂 ，参 与 OA的病理过程_l。张洪等¨ 通过 比较兔膝骨关节炎软骨与正常兔膝软骨 ，发现软骨细胞 中 ：M 的表达在兔膝骨关节炎模型组阳性率均高于对照组 ，同时实 验组软骨细胞凋亡的程度与 ot：M 的表达呈负相关 ，表明 仅M 与 骨关 节 发 生 发 展 有 密切 关 系。林 子 洪等-1通过对创伤性兔膝骨关 节炎模型采用 仅：M关节 内注射与阴性对照 比较 ，发现 otM 治疗组的半 月板退变速度稍慢 ，半月板纤 维和细胞情况较好 ，其对关节炎症有直接 的抑制作用 ，但对滑膜炎症 的抑制作用较弱 ，提示 M可能适 合 OA发病初期 的保 护性治疗和研究 。而李蔚勃等 通过文献研究分析总结 M对骨关节炎的影响可能是通过抑制 MMP参与 自由基的清除 ，通过转运 细胞 因子调节 MMP1的合成与代谢参与免疫过程 ，但其具体机制 尚待进 一步研究。
本实验 OA组血清 ot：M的升高，可能是由于 OA 机体 自身对抗疾病的一个保护性机制导致其分泌增多 ，而其是否与关节软骨局部的表达水平一致 ，以及与 OA发病机制的具体关系尚待进一步研究 。
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