摘要：通过在室内无光照条件下开展干扰实验，探究了荧光素钠、罗丹明和荧光增白剂三种示踪剂之间的干扰规律，并应用于野外地下水二元示踪试验实例，说明了校正荧光示踪仪检测浓度(ΔC)的方法。结果表明：(1)在实验室条件下，荧光素钠的抗干扰性最强，罗丹明次之，荧光增白剂易受到干扰产生检测浓度增大的假象，这种假象服从线性变化规律;(2)当使用罗丹明作为示踪剂时，ΔC钠=0.052C罗、ΔC白=0.012C罗;当使用荧光素钠时，ΔC罗=0.507C钠、ΔC白=0.323C钠。在野外开展二元示踪试验时，建议尽量选用相互之间干扰较小的罗丹明和荧光增白剂进行组合投放，或利用本实验得到的不同示踪剂之间的干扰规律对荧光示踪仪的检测浓度进行校正。
关键词：荧光示踪剂;干扰实验;检测浓度;浓度校正;多元示踪试验
0引言
地下水示踪试验是岩溶水文地质调查的一种重要方法，其发展经历了从定性到定量、从单元到多元的发展阶段，最初的示踪试验是在某一可能的补给区将木屑、谷壳、塑料制品等颗粒漂浮物作为示踪剂[1-2]，投放到落水洞或伏流中，然后在下游用肉眼监测，确定岩溶地下水是否连通，故早期这种地下水示踪试验也称之为“连通试验”，这种方法主要是用于定性确定地下水的连通关系，获取的水动力参数精度较低。自20世纪80年代以来随着化学分析测试技术的发展，一些易溶于水的化学试剂逐渐应用于地下水示踪试验中，例如氯化钠[3-4]、钼酸铵[5-6]等，大大提高了地下水示踪技术的发展，但因有些试剂在地下水中背景值较高、现场检测技术方法和成本等的限制，地下水示踪技术在水文地质勘察和研究中的应用尚不够普及。21世纪以来随着野外便携式荧光示踪仪的研制成功[7]，应用荧光素染料[主要为荧光素钠(Uranine)[8-10]、罗丹明(Rhodamine)[11-13]、荧光增白剂(Tinopal)[14-16]等]进行示踪试验具有用量少、分辨率高、监测方便的特点，已成为岩溶水文地质勘察和地下水污染研究的重要技术方法[17-22]，在查明岩溶地下水水力联系、划分岩溶地下水系统、分析岩溶含水介质特征、确定地下水流速、水动力弥散系数等水文地质条件及参数研究中发挥着重要作用[23-27]。
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在岩溶发育的地区经常会遇到复杂的地下暗河系统，多表现为存在着多个落水洞或伏流入口等地下水补给源，此时仅靠一种示踪剂则难以查明复杂的水文地质条件，并且耗时也极长，因此需要在不同来源同时投放多种示踪剂开展多元示踪试验[28-37]。以往国内外广泛使用野外荧光示踪仪来进行在线监测[10]，但是由于荧光示踪仪是通过间接的方法计算得到某种示踪剂的浓度，在多种示踪剂并存的条件下，示踪剂之间有可能发生干扰，造成示踪剂检测浓度的误差[38]，如果不对其进行校正，甚至可能会对水文地质条件产生误判，计算得到错误的水文地质参数。另外，随着现在环境保护意识的增强，一般不宜大剂量投放示踪剂，否则容易造成河流变色引起恐慌[39]，因此在开展多元低浓度示踪试验时，如何选择示踪剂、如何消除示踪剂之间的干扰是提升地下水示踪试验应用效果、正确认识水文地质条件和准确获取地下水信息与参数的重要研究内容。目前有学者对比了荧光素钠和罗丹明两种示踪剂在同一野外环境条件下进行示踪试验时示踪剂浓度的历时曲线[40]，也有学者提出利用联立线性方程组求解的方法分离出不同的示踪剂[38]，但国内外鲜有研究荧光示踪剂之间的干扰规律。本文以荧光素钠、罗丹明、荧光增白剂三种常用的示踪剂作为研究对象，通过室内干扰实验，探究不同示踪剂之间的干扰规律，并应用于野外地下水二元示踪试验实例，说明校正荧光示踪仪的检测浓度的方法，以期为消除示踪剂之间的干扰，获得准确的地下水信息提供参考。
1示踪仪工作原理及示踪剂干扰原因
某些物质受到紫外线的照射激发时，能够发射出不同波长、强度的可见光，而当紫外线停止照射时，物质所发射的光线也随之消失，这种光线称之为荧光，发光的原理与电子的能级跃迁有关[41]。荧光物质由于分子结构的特殊性，其对光的吸收具有选择性，即不同波长的激发光便会产生不同波长、强度的发射光，因此根据荧光物质激发光谱和发射光谱的特性，可以分别确定不同荧光示踪剂的最佳激发与发射波长，进而建立示踪剂的检测条件[42]。
荧光示踪仪正是利用以上特性，设计针对不同示踪剂的光学激发器和接收器，激发器形成某种示踪剂对应的最佳激发波长下的激发光，该激发光被待测溶液吸收后发射出不同波长、强度的荧光，仪器选择性接收某种示踪剂对应的最佳发射波长下的发射光，然后根据其荧光强度与示踪剂实际浓度的关系，通过标准函数计算出示踪剂的检测浓度。荧光示踪仪一般具有多路激发光和接收光系统，可同时检测三种示踪剂(如荧光增白剂、荧光素钠、罗丹明等)的浓度(图1)。
荧光增白剂、荧光素钠和罗丹明是三种常用的示踪剂，它们在受到激发时会发射出不同波长、强度的发射光，其分布如图2所示，最佳发射波长下的荧光强度最大，向两端逐渐减小，呈高斯曲线形状，其中荧光素钠的最佳发射波长(520nm)介于荧光增白剂的最佳发射波长(438nm)和罗丹明的最佳发射波长(580nm)之间[43-47]。
根据示踪仪的检测原理以及示踪剂的发射光分布图可知，在利用示踪仪同时检测上述三种示踪剂时，示踪剂之间会产生干扰，原因及过程如下：
(1)当激发荧光素钠时，会发射出不同波长、强度的荧光(包含520nm、438nm、580nm)，其中438nm和580nm的荧光被荧光增白剂和罗丹明接收器错误地识别，从而产生荧光增白剂和罗丹明检测浓度变化的假象;
(2)当激发罗丹明时，会发射出小于最佳发射波长(<580nm)的其他荧光，其中有少量520nm的荧光被荧光素钠接收器错误地识别，产生荧光素钠检测浓度变化的假象，由于荧光增白剂的最佳发射波长(438nm)和罗丹明的最佳发射波长(580nm)相隔很远，罗丹明发射出的438nm荧光微乎其微，几乎不会造成荧光增白剂检测浓度的误差;
(3)当激发荧光增白剂时，虽会发射出大于最佳发射波长(>438nm)的其他荧光，但其最大波长小于520nm，即无法被荧光素钠和罗丹明的接收器识别，不会产生荧光素钠和罗丹明检测浓度变化的假象。
本研究将通过室内干扰实验验证上述理论分析，并进一步确定检测浓度的误差大小和变化规律。
2实验与方法
2.1示踪剂及检测仪器
实验选择荧光素钠、罗丹明以及荧光增白剂三种示踪剂，其中荧光素钠(C20H10Na2O5)溶于水后成绿色，罗丹明(C28H31O3N2Cl)溶于水后呈红色，荧光增白剂(C28H20S2O6Na2)溶于水后呈白色。
示踪剂检测仪器采用瑞士Neuchatel大学生产的野外荧光示踪仪(flow-throughfieldflourometer)GGUN-FL30，该示踪仪通过数据采集器CR850(美国CampbellScientific公司生产)与计算机连接，可同时在线检测上述三种荧光示踪剂的浓度(精度为0.01μg∙L-1)，实验检测时间步长为5s。
本次实验使用的示踪仪为新仪器，在出厂前进行了三种荧光示踪剂标准溶液下的校正，校正程序已写入了CR850数据采集器中，可直接用于示踪剂检测。
2.2实验装置
在室内设计了一套由供水箱、离心泵和明渠组成的水流自循环装置(图3)。示踪剂先在供水水箱中充分溶解混合，然后由离心泵抽入明渠，在明渠中放置野外荧光示踪仪对流经水流中的示踪剂浓度进行检测，检测后的水流再回流至供水水箱，不断往复。为了防止光照对示踪剂浓度的影响，实验过程中用遮光布将装置覆盖。
2.3实验方法
为提高实验的精度，保证实验结果的可靠性，本实验是在室内白天遮光条件下进行，为了排除浊度对示踪剂的干扰，实验采用纯净水(2NTU)来溶解各种荧光素，在实验过程保持水体的浊度基本不变。
室内干扰实验是在上述水流装置中只投放某一种示踪剂，在该示踪剂不同浓度的情况下，用示踪仪同时检测水中三种示踪剂的浓度变化，以获得当水中只有某一种示踪剂时，示踪仪检测得到的其他两种并不存在的示踪剂，其浓度随实际存在的某一种示踪剂浓度变化而变化的规律，并探究两者之间是否存在干扰现象以及这种干扰现象是否具有相关关系和相关方程的具体表达式(表1)。实验步骤如下：
步骤1，首先在不加入任何示踪剂的纯水情况下，启动自循环系统，读取示踪仪中荧光素钠、荧光增白剂、罗丹明三种示踪剂的检测浓度，作为纯水的背景值;
步骤2，将一定质量的某一种示踪剂加入供水箱中，充分溶解后读取示踪仪中三种示踪剂的检测浓度;
步骤3，在供水箱中继续加入一定质量的上述示踪剂，充分溶解后再读取示踪仪中三种示踪剂的检测浓度;不断重复步骤3，获得水流中不存在的另两种示踪剂检测浓度与实际存在的某一种示踪剂浓度的变化关系;
步骤4，用纯水清洗自循环装置，投放的示踪剂更换为第2种示踪剂，重复步骤1~3;
步骤5，用纯水清洗自循环装置，投放的示踪剂更换为第3种示踪剂，重复步骤1~3。
3结果分析与讨论
根据上述实验的数据分别绘制了单独投放荧光增白剂、罗丹明和荧光素钠的情况下，各示踪剂检测浓度的关系图(图4、图5、图6)、示踪剂检测浓度相关方程(表2)。
实验结果表明：
(1)由图4可知，在单独投放不同浓度荧光增白剂时，仪器检测的罗丹明和荧光素钠浓度基本在背景值附近随机波动，说明荧光增白剂不会对罗丹明和荧光素钠检测浓度产生干扰。
(2)由图5可知，在单独投放不同浓度罗丹明时，随着罗丹明浓度的增大，荧光增白剂和荧光素钠的检测浓度也有一定程度的增高，且两者呈正相关关系，说明投放罗丹明会产生荧光增白剂和荧光素钠检测浓度增大的假象，荧光增白剂检测浓度(ΔC白)与罗丹明实际浓度(C罗)的关系是：ΔC白=0.012C罗。荧光素钠检测浓度(ΔC钠)与罗丹明实际浓度的关系是：ΔC钠=0.052C罗。这个增量分别为1.2%和5.2%，说明罗丹明对荧光增白剂和荧光素钠的影响不大，在低浓度投放罗丹明时基本可以忽略其影响，在高浓度投放时可用上述方程对仪器的检测浓度进行校正。
(3)由图6可知，在单独投放不同浓度荧光素钠时，随着荧光素钠浓度的增大，罗丹明和荧光增白剂检测浓度会出现显著的增高，且两者也呈正相关关系，说明荧光素钠会对罗丹明和荧光增白剂的检测浓度产生显著的干扰，这种干扰也服从线性正相关关系，即：罗丹明检测浓度(ΔC罗)与荧光素钠实际浓度(C钠)的关系是：ΔC罗=0.507C钠。荧光增白剂检测浓度(ΔC白)与荧光素钠实际浓度的关系是：ΔC白=0.323C钠。这个增量分别为50.7%和32.3%，也就是说当采用荧光素钠作为示踪剂时，易产生罗丹明和荧光增白剂仪器检测浓度变化的假象，这种假象可用上述方程进行校正。
上述实验荧光素钠、罗丹明和荧光增白剂之间会产生相互干扰，并且这种干扰现象及规律与前文示踪剂发射光分布图所示的干扰原因相符合。在实验室条件下，荧光素钠的抗干扰性最强，罗丹明次之，荧光增白剂容易受到荧光素钠和罗丹明的干扰而产生仪器检测浓度变化的假象。在野外条件下，由于日常生活中常使用含有荧光增白剂的相关物质[48]，自然水体中的荧光增白剂浓度容易受到环境的影响;而罗丹明吸附性较强[49]，天然岩溶管道系统中的泥沙对罗丹明有一定的吸附，因此在开展地下水示踪试验时，首选荧光素钠作为示踪剂[50]。但是在开展多元示踪试验时，建议尽量选用罗丹明和荧光增白剂进行组合投放，若采用荧光素钠与其他示踪剂组合投放时，可用上述相关方程对仪器的检测浓度进行校正，得到各示踪剂的实际浓度历时曲线，并据此分析岩溶地下水系统的发育特征和计算相关的水文参数。4应用实例当采用多种荧光示踪剂在野外开展地下水多元示踪试验时，获取真实的示踪剂浓度历时曲线变化过程，是准确确定地下水来源、地下水文信息和参数的关键，以下将利用在野外开展的地下水示踪试验，分析如何利用上述实验结果对野外试验数据再处理。4.1二元示踪试验设计研究对象位于湖北省恩施州咸丰县后家河流域，在该流域的滴水岩岩溶水系统中开展了多元示踪试验，试验部署如表3和图7所示。在滴水岩地下暗河出口处用GGUN-FL30野外荧光示踪仪自动检测荧光增白剂和荧光素钠2种示踪剂的浓度变化，每5min记录一次数据。4.2监测曲线特征及校正本次示踪试验在Ⅰ号、Ⅱ号入口分别投放荧光增白剂和荧光素钠，在滴水岩暗河出口示踪仪检测到的示踪剂浓度历时曲线如图8所示。
