摘要：目的分析四角蛤蜊醇沉上清中脂肪酸及甾醇类成分。方法采用气相色谱一质谱(GC—MS)联用技术对四角蛤蜊醇沉上清中脂肪酸类、甾醇类成分进行分析与鉴定。结果共分离鉴定出35种脂肪酸，占总脂肪酸含量的97.74%，其中17种饱和脂肪酸的相对含量为54.52，主要为十六烷酸、十八烷酸等;18种不饱和脂肪酸的相对含量为43.22，主要为9一十六烯酸、6一十四烯酸、EPA等。共分离鉴定出1O种甾醇，包括3种胆甾醇、3种麦角甾醇、2种豆甾醇、岩甾醇及雄甾醇各1种，其中胆甾醇含量最高为63.38，其次为麦角甾醇2O.8l与豆甾醇9.68。结论以GC—MS联用技术分析了四角蛤蜊醇沉上清中的脂肪酸类、甾醇类成分，为四角蛤蜊资源的综合开发利用提供科学依据。
关键词：四角蛤蜊;醇沉上清;脂肪酸;甾醇;GC—MS
四角蛤蜊(Mactraveneriformis)属于软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲(Lamellibranchia)，真瓣鳃目(Eularnellibranchia)蛤蜊科(Mactridae)，是一种广泛分布于我国南北各海区的较大型低值经济贝类。其贝壳和软体部分在中医理论中均有记载可药用，明·李时珍《本草纲目》记载：蛤蜊肉“止消渴，开胃，治老癖，能为寒热及妇人血块”。现代研究表明四角蛤蜊具有免疫调节、辅助降低血糖、抗氧化等功效，这与四角蛤蜊物质基础紧密相关，目前已报道蛤蜊中含有多糖类、蛋白质类、氨基酸类、脂类等物质一。
本课题组前期对四角蛤蜊提取物进行醇沉沉淀，沉淀部位具有免疫调节及辅助降血糖功能，其主要含有多糖类成分n]。醇沉上清部位具有较好的抗氧化作用，而其抗氧化功效物质基础仍不明确。现有的研究报道表明海洋软体贝类中含有丰富的不饱和脂肪酸类物质，如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等，这些物质具有降低血中胆固醇、促进细胞生长发育、提高学习记忆能力、预防老年痴呆等作用]。本文采用GC—MS联用技术，对四角蛤蜊醇沉上清提取物的脂肪酸类及甾醇类物质组成进行了分析鉴定，为综合开发利用四角蛤蜊资源提供科学依据。
1材料
1.1四角蛤蜊提取物
四角蛤蜊水提醇沉上清液浸膏，实验室制备获得_4]，四角蛤蜊由江苏省海洋水产研究所提供，批号：20100706，经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为蛤蜊科动物四角蛤蜊(Mactravenerifor一isReeve)。
1.2实验试剂
三氯甲烷(中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20010306);色谱甲醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080215)，三氟化硼乙醚(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：0411S05);正己烷(南京化学试剂厂批号：0628S04);其余试剂为国产分析纯。1.3实验仪器FA1104型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);组织绞碎机(广东南海德丰电热设备厂);725BASIC高速匀浆机(IKA公司);电热恒温干燥箱202型(上海索谱仪器有限公司);HH一4数显恒温水浴锅(自华电器有限公司);旋转蒸发仪(BUCHIRotavaporR114);80～2B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造);Agilent5975型GC—MS气质联用仪。
2方法与结果
2.1石油醚萃取法萃取脂肪酸
称取8.15g四角蛤蜊醇沉上清的真空干燥样品，用水溶解，置于分液漏斗中，分别加入9次1000mL石油醚，合并萃取液，减压浓缩除去石油醚得浸膏，为石油醚萃取部位。6O℃真空干燥后，加入一定体积的甲醇一三氯甲烷一水混合溶液(体积比为2：1：0.8)，电磁搅拌下室温过夜，离心分离提取液，加入一定量的三氯甲烷和水，使提取液的最终浓度保持为甲醇：三氯甲烷：水一1：1：0.5(v/v)，分离有机相，真空旋转蒸发除去有机溶剂得油状物。
2.2脂肪酸萃取物的甲脂化
取适量“2.1”项下萃取获得的脂肪酸置于10mL的具塞试管中，分别依次加入1O%的KOH一南京中医药大学学报2012年7月第28卷第4期MeOH溶液2mL，在6O℃条件下皂化30min，待油珠完全消失后，冷却，加入2mL三氟化硼乙醚一甲醇(三氟化硼乙醚：甲醇一1：3，V/V)溶液并于60℃水浴甲酯化30min，冷却后，加正己烷4mL，离心分层，取上清加等体积的水，洗至有机层呈中性。加无水硫酸钠静置过夜，过滤加正己烷复溶，进行GC—MS分析。
2.3甾醇的提取
取适量“2.1”项下油状物置于1OmL的具塞试管中，分别依次加入1O的KOH水溶液5mL，在60℃条件下皂化30min。冷却后用乙醚萃取3次，每次5mL。合并乙醚萃取液，再用水洗3次，每次10mL。取乙醚层加无水硫酸钠适量，静置过夜。去上层乙醚层3O℃旋转蒸发，得黄色固体。加适量无水乙醇复溶，静置析晶。取晶体加正己烷复溶，进行GC—MS分析。
2.4GC—MS分析
2.4.1气相条件
色谱柱AgilentHP一5，石英毛细管色谱柱(o.25mm×3Om，0.25m);进样口温度200℃，检测器温度250℃;程序升温：初始温度180℃，保持40min，以5℃/rain的速率升温至200℃保持10min，以2℃/min的速率升温至210℃保持2Omin，进样量：1L;载气为氦气，流速为1.0mL/min。2.4.2质谱条件
EI离子源，电离电压70eV，离子源温度220℃，加速电压200eV;扫描质量rn/z35～550。
2。5结果
按照上述条件对四角蛤蜊醇沉上清中脂肪酸及甾醇进行分析，分别得到脂肪酸及甾醇的GC—MS总离子流图，见图1～2。根据图中各组分的离子碎片质量谱图，通过检索NIST谱图库并参考标准质谱谱图，从中确定了35种脂肪酸及10种甾醇类物质。运用峰面积归一化法，测得各化学成分的相对百分含量。结果见表1～2。
从表1中看出，四角蛤蜊醇沉上清中含有年富的脂肪酸类成分，其中饱和脂肪酸17种，占脂肪酸总量的54.52，以十六烷酸(38.86)、十八烷酸(6.80)等为主;不饱和脂肪酸18种，占脂肪酸总量的43.22，以9一十六烯酸(12.20)、6一十四烯酸(6.41)、EPA(5.21)等为主。从表2中看出，四角蛤蜊醇沉上清中检测出10种甾醇，包括3种胆甾醇、3种麦角甾醇、2种豆甾醇、1种岩甾醇及1种雄甾醇。其中胆甾醇含量最高为63.38，其次为麦角甾醇20.81，豆甾醇含有9.68。
3讨论
EPA和DHA作为重要的多不饱和脂肪酸，在营养和医学领域发挥着重要作用，如EPA被称为是“血管清道夫”，可使血液黏度降低，红细胞可塑性增加，从而改善冠状动脉血液循环，具有疏导清理心脏血管的作用，DHA能抑止脑细胞老化，活化脑细胞，是大脑细胞形成发育及运作不可缺少的物质基础，具有补脑健脑的作用。
此外，四角蛤蜊醇沉上清中还含有甾醇类物质，甾醇是所有真核生物细胞膜的主要成分，它们的结构特征诸如烷基侧链、内部甲基化及双键位置在化学分类学上具有重要意义[5]。传统理论认为麦角甾醇一般存在于真菌中，豆甾醇存在于植物中，而我们在四角蛤蜊醇沉上清中检出了麦角甾醇与豆甾醇，在四角蛤蜊组织中鉴定豆甾醇是首次报道，这可能与贝类生长环境和摄食种类有关。这些甾醇类化合物具有广泛的生理活性，如豆甾醇能有效降低血清中胆固醇的浓度;岩藻甾醇对保持生物内环境稳定、控制糖原和矿物质的代谢、调节应激反应等方面有重要作用_6]。
四角蛤蜊醇沉上清具有良好的抗氧化作用，能够清除自由基，升高机体SOD、GsH、CAT等抗氧化酶的活性，本文通过GS—MS对四角蛤蜊醇沉上清中的脂肪酸类、甾醇类物质进行了分析鉴定，探讨四角蛤蜊醇沉上清抗氧化活性的功效物质基础，为进一步深入开发四角蛤蜊以及江苏沿海丰富的低值贝类资源提供科学依据。
期刊推荐：《中药药理与临床》是中国药理学会主办、中国药理学会中药药理专业委员会具体承办的中药药理学专门学术刊物，创刊于1985年，历届主编、常务副主编都是中国药理学会/中药药理专业委员会主要负责人。主要刊载中药药理学基础和应用基础研究论文，也刊载天然产物基础与开发研究论文，辟“名方研究”、“实验研究”、“临床研究”、“思路与方法学探讨”、“综述”等主要栏目，载文数量每期约35～40篇，其中各种基金资助的研究课题所撰写的学术论文约占1/3。
