摘要:目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体，表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列，转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达，利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16.5融合蛋白表达载体，并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化，研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0.5mmol、37℃条件下诱导4h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体，得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白，为进一步研究其功能奠定基础.
关键词:热休克蛋白;聚精氨酸;原核表达;亲和层析
热休克蛋白(Heatshockproteins，HSP)是一类广泛存在于原核细胞和真核细胞中，与细胞损伤和修复相关的热应激蛋白质.根据其分子量大小热休克蛋白分为5类:HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白(smallHeatShockProteins，sHSP)[1-2].sHSP能够通过形成多聚体结构行使其特有功能，如赋予细胞耐热性和作为分子伴侣协助蛋白质完成折叠、组装等过程[3].在sHSP众多成员中，从詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)分离到一种分子量约为16.5kDa的HSP(又称为HSP16.5)，研究发现:24个HSP16.5单体能够组装成外径12nm、内径6.5nm的空心球形聚合体[4-5].HSP16.5能自组装形成中空球形的纳米笼结构，其笼内腔可以用来担载药物，笼外表面可以引入肿瘤靶向基团，因此，近年来基于HSP16.5纳米笼的药物输送研究取得了重要进展[6-9].
阳离子多肽是一类主要由含正电荷氨基酸(如赖氨酸、精氨酸)组成的小分子量多肽，由于其富含正电荷，可以通过静电吸附担载带负电荷的核酸(如siRNA和pDNA)类药物，因此，被广泛应用于核酸类药物的输送体系研发[10-11].在众多阳离子多肽中，聚精氨酸九肽(R9)研究最为深入.已有多项研究显示:引入聚精氨酸九肽的纳米颗粒能够吸附负电荷的核酸类药物，并与之形成稳定的复合体结构.复合体被细胞内吞后随即释放，显示了其在核酸类药物运输中的巨大潜力.本研究在HSP16.5表达载体的基础上对载体进行改造，引入精氨酸九肽对应的DNA序列，构建HSP16.5-R9表达载体，并对其原核表达进行条件优化，最后通过亲和层析方法纯化融合蛋白，为进一步研究HSP蛋白纳米笼的核酸输送功能奠定基础.
1材料与方法
1.1试验材料
PMSF(Sigma公司);IPTG(BBILifeScience公司);氨苄西林、DNA和蛋白质标准品(北京鼎国);质粒提取试剂盒和Ni-NTA亲和树脂(上海生工公司);基因定点突变试剂盒、DNA纯化试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术公司);质粒pET21a(+)-HSP由日本九州大学MasaharuMurata惠赠;大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由本实验室保存;HeLa和HeLa-EGFP细胞(中科院上海细胞库).
1.2试验方法
1.2.1HSP-R9蛋白原核表达载体的构建
根据HSP16.5基因序列设计引物引入R9对应的DNA序列(下划线):sense引物primer5’AAGAAAGGAATCAACATTGAACGACGACGCCGACGCCGACGCCGTCGACTCGAGCTCCACCACCACC3’;antisenseprimer5’GGTGGTGGTGGAGCTCGAGTCGACGGCGTCGGCGTCGGCGTCGTCGTTCAATGTTGATTCCTTTC3’.利用上述引物进行PCR反应，反应条件:94℃预变性5min，94℃30S，55℃60S，72℃6min，共18个循环，68℃10min.反应结束后，取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳;将剩余PCR产物纯化后加入DpnΙ进行酶切，以去除模板DNA，37℃孵育30min，取10μL酶切产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，次日挑取单克隆摇菌过夜，提取质粒送库美生物科技有限公司进行测序.
1.2.2HSP-R9融合蛋白的原核表达
将测序正确的pET21(+)-HSP-R9质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆接种于20mL的LB培养基中，37℃摇菌过夜;第2天按1∶100接种于1LLB培养基中，当菌液OD600达到0.5～0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol)37℃诱导4h;离心收集菌体，加入细胞裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，20mmolimidazole，1mmolPMSF)超声破碎，离心收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测.
1.2.3HSP-R9蛋白的原核表达条件优化
挑取单克隆扩大培养，当菌液OD600nm值达到0.5～0.6时，加入IPTG(终浓度分别为0，0.1，0.2，0.3，0.5，1mmol)37℃诱导4h;离心收集菌体，加入含有尿素的裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolImidazole，1mmolPMSF)，离心收集上清液，进行SDS-PAGE检测.
挑取单克隆扩大培养，当菌液OD600nm值达到0.5～0.6时，加入IPTG(终浓度为0.5mmol)，检测37℃诱导0，1，2，3，4和6h条件下的蛋白表达情况;离心收集菌体，加入含有尿素的裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolImidazole，1mmolPMSF)，离心收集上清液，进行SDS-PAGE检测.
1.2.4HSP-R9蛋白的亲和纯化
在菌体裂解液中加入Ni-IDA亲和树脂，转到孵育30min后离心收集树脂，然后加入WashBuffer洗涤10次，洗去非特异性结合蛋白，直至洗涤液中不含蛋白为止;将Ni-IDA树脂加入ElutionBuffer(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolimidazole，1mmolPMSF)中，室温孵育30min，离心收集洗脱液，重复洗脱两次，收集洗脱液;洗脱产物，进行SDS-PAGE检测.
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2结果与分析
2.1HSP-R9原核表达载体的构建结果
本研究在pET21(+)-HSP表达载体的基础上，采用点突变方法将R9对应在DNA序列HSP基因的C末端，从而构建HSP-R9的原核表达载体.首先设计突变引物，进行PCR诱导的定点突变:95℃预变性5min，95℃30s、55℃1min、68℃7min，18个循环，然后用限制性内切酶DpnI将模板DNA降解，取酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆提质粒，测序.DNA测序结果见图1.在HSP基因末端引入了R9对应的DNA序列，且未发现其他位点的突变，提示聚精氨酸对应的DNA序列被成功插入到pET21(+)-HSP载体中.
2.2HSP-R9融合蛋白的原核表达结果
将测序正确的HSP-R9表达载体转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆扩大培养，待细胞生长至对数生长期后加入诱导剂IPTG，37℃诱导4h检测目的蛋白表达情况.SDS-PAGE电泳结果见图2.HSP和HSP-R9融合蛋白均以不溶性的形式存在于菌体裂解液沉淀中，在上清中未发现两种蛋白的明显表达.从电泳条带粗细初步判断，在同样表达条件下HSP-R9蛋白表达量较HSP要少.因此，在接下来的操作中，我们采用了含有尿素的裂解液破碎菌体以溶解包涵体.
2.3HSP-R9融合蛋白的原核表达条件优化结果
2.3.1不同IPTG浓度的HSP-R9融合蛋白产量
为获得HSP-R9蛋白表达的最优条件，我们从诱导剂IPTG浓度和诱导时间两个因素进行了表达条件优化.结果见图3.在0.1，0.2，0.3，0.5mmolIPTG诱导下，目的蛋白表达量逐渐增加;然而0.5mmol和1mmolIPTG诱导下的目的蛋白表达量未见明显增加(第4和第5泳道)，因此，在接下来的研究中我们采用0.5mmolIPTG进行诱导表达.
2.3.2不同诱导时间的HSP-R9融合蛋白产量
诱导时间也是影响原核蛋白产量的重要因素.本研究中，我们检测了加入诱导剂后37℃诱导0，1，2，3，4，6h的目的蛋白表达情况.表达结果见图4.诱导0h的菌体裂解液中无目的蛋白表达，诱导1，2，3，4，6h的菌体裂解液中均发现有目的蛋白存在，且随着诱导时间延长产量逐渐增加.由于诱导4h和6h的菌体裂解液中目的蛋白产量未见明显区别，因此，在以后扩大生产中采用37℃诱导4h进行.
2.4HSP-R9的蛋白纯化结果
由于HSP-R9表达载体上带有组氨酸标签，因此，HSP-R9融合蛋白是带有镍离子的树脂利用亲和层析的方法进行的蛋白纯化.菌体裂解液与NiNTA树脂结合后，经多次洗涤，去除非特异性结合的蛋白后用高浓度咪唑溶液进行洗脱.结果见图5.电泳泳道中纯化后的HSP和HSP-R9蛋白条带单一，无明显可见的蛋白杂带出现.这说明我们纯化的HSP-R9蛋白溶液中目的蛋白纯度较高，可用于下一步的功能检测.
3讨论
晶体学研究显示:24个小热休克蛋白HSP亚基能够组装成对称性的直径为12nm球形结构，并且在温度达到70℃和pH4～11的范围内保持结果完整性[4].正因为蛋白纳米笼上述的特殊结构及理化特性，近年来在蛋白纳米笼肿瘤成像和药物转运方面取得了重要进展.在肿瘤靶向方面，美国蒙大拿州立大学的TrevorDouglas课题组分别将短肽RGD4C(CDCRGDCFC)，SP94(SFSIIHTPILPL)引入HSP蛋白C-末端生成融合蛋白，组装成的蛋白纳米笼具有靶向识别黑色素瘤细胞及肝癌细胞的特性;在肿瘤成像及诊断方面，TrevorDouglas课题组通过基因突变在HSP蛋白引入半胱氨酸，利用半胱氨酸巯基与马来酰亚胺功能化的荧光素缩合得到了荧光素标记的纳米笼[5].因此，开发具有新型功能的HSP蛋白纳米笼具有重要意义.
本研究在HSP序列的C末端引入聚精氨酸九肽，制备融合阳离子肽的HSP蛋白纳米笼用于核酸类药物的输送，探索开发基于蛋白纳米笼的siRNA高效转运体系，对开发设计智能、安全和高效的核酸类药物载药体系具有重要意义.
本研究成功构建了小热休克蛋白与聚精氨酸九肽(HSP-R9)融合蛋白的原核表达载体，并对HSP-R9的原核表达条件进行优化(IPTG浓度为0.5mmol、37℃诱导4h)，通过亲和层析方法对HSP-R9蛋白进行了纯化，得到了高纯度的HSP-R9蛋白，为下一步研究HSP-R9蛋白纳米笼的功能奠定了基础.
