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化学对照品色谱纯度检测的影响因素

分类:科技论文 时间:2020-03-21

  摘要:目的探索在药品对照品标化中色谱条件的影响因素。方法以2个待标化的对照品为例,采用HPLC—DAD法对其纯度进行预标化。结果在HPLC中色谱柱类型、流动相的比例、柱温、流速、检测波长对其纯度检查均有一定的影响。结论色谱条件的影响因素较多,在实际应用中可综合考虑。

化学对照品色谱纯度检测的影响因素

  关键词:纯度分析;对照品;高效液相色谱一二级管阵列检测

  化学对照品是在结构、性质完全清楚的基础上,专供物理和化学测试时用于与供试药品进行对照的物质,其纯度适合于使用要求并且质量均一的实物样品[1]。在我国,对照品的精制及标化分装均由中国食品药品检定研究院(原中国药品生物制品检定所,简称中检所)承担。2010年,我所参与了部分新版药典用化学对照品的标化工作,除按《中国药典》2010年版对待标对照品进行纯度分析外,还需与美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典(BP)、日本药典(JP)等分析结果比较,分析各国药典方法的结果差异性。本文以2个对照品为例,探讨在对待标品进行纯度检查时色谱条件的影响因素。

  1仪器与试药

  Waters2690—996二极管阵列检测器,高效液相色谱系统(Waters公司),AE-240电子天平(梅特勒公司),ZF一1三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。乙酰谷酰胺对照品(批号:100859)、环扁桃酯对照品(批号:101118~201001)(中国食品药品检定研究院)。甲醇、乙腈均为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为纯化水。

  2《中国药典及其他各国药典收载分析方法情况

  将2个对照品在《中国药典》及其他各国药典收载情况进行检索,分析方法收载情况见表1。

  3对照品标化中对色谱峰的纯度要求

  对照品标定作业指导书明确指出:尽量采用《中国药典》的液相或者气相方法进行纯度检查,如果国外药典的色谱系统与《中国药典》不一致,也需同时考察。HPLC法采用PDA检测器,采用面积归一化法和主成分自身对照法,供试品浓度的确定,以0.1浓度信噪比大于10为基础,对供试品溶液的主峰进行纯度检查,若不纯,对色谱条件进行调整直到纯度检查通过;可见色谱条件的优化程度直接关系到峰纯度。

  “峰纯度”测试是将某个峰中的光谱与其峰顶点光谱进行比较,以确定该峰是否包含光谱不同的组分_2]。PDA可以获得样品的色谱图及每个色谱组分的光谱图,即提供三维光谱一色谱图(3D-谱图)。纯峰与不纯峰在Waters2690—996纯度识别见图1,纯峰与不纯峰的纯度角度及纯度阈值结果见表2。

  4试验

  4.1乙酰谷酰胺HPIC纯度标化过程的影响因素

  4.1.1色谱柱的选择

  在对乙酰谷酰胺对照品标定中,采用3种不同厂家的色谱柱:LichrospherC18柱(4.6mm×250mm,5/~m)(汉邦科技);XBridge州C18柱(4.6ramx250mm,5gin)(广州菲罗门);CapcellPAKC18柱(4.6mm×250mm,5/~m)(日本资生堂)。流动相:0.05mol·I2磷酸二氢钾溶液(用1o磷酸调节pH值至2.99)一甲醇(95:5)41;检测波长:210nm;进样体积:2OL;流速:1.0mL·min;柱温:3O℃;DAD扫描波长:190~800nm;供试品溶液的浓度:lmg·mI;对照品溶液的浓度:1p.g·mI~。乙酰谷酰胺在不同厂家色谱柱的色谱图见图2。

  从图2可见LichrospherC18色谱柱(4.6ram×250mm,5/~m)(汉邦科技)峰形较好,但纯度未通过(纯度角度为4.532,纯度阈值为0.349),因此选择LichrospherC18柱为该品种纯度测试的色谱柱。

  4.1.2流动相比例的凋节

  色谱峰的保留时间较短,将流动相适当调节,发现将有机相调节到1时,色谱峰的保留时间为5min左右,说明乙酰谷酰胺峰对甲醇的敏感度不高,且峰纯度未通过,可以从柱温、流速、进样量进行适量的调节。

  4.1.3DAD扫描波长的选择

  扫描波长时发现甲醇的基质影响较大,乙酰谷酰胺因为甲醇的截止波长为205nm,在设定DAD色谱峰纯度角度均是纯度阈值的10倍以上,纯度未通过。为消除该影响,笔者将DAD扫描波长设定为205~800nm。

  4.1.4柱温、流速、进样量的选择

  在试验中,将柱温适当降低,流速降低,色谱峰保留时间为llmin左右,峰纯度角度为0.498,而纯度阈值为0.358,纯度未通过;在保证0.1对照溶液主峰的信噪比为17.3时,将进样量调节至1oL,乙酰谷酰胺色谱峰纯度角度为0.268,纯度阈值为0.308,纯度通过。

  可见,在使色谱峰纯度通过并满足0.1对照溶液的色谱峰的信噪比为1O的基础上,色谱柱类型、扫描波长范围、流动相组成成分比例的变化、柱温、流速、进样量的选择对色谱峰的纯度有一定的影响。

  4.2环扁桃酯有关物质检测波长的选择

  在对照品标化中,纯度测定方法选用色谱法,如HPLC检查采用二极管阵列检测器检测色谱峰纯度,TLC检查结果可作为HPLC检查结果的参考引。

  环扁桃酯对照品标化HPLC纯度方法色谱条件:以CapcellPAKC18(4.6mm×250ram,5m)为色谱柱,乙腈一水(4:1)为流动相,检测波长为228nm(方法与USP32一NF27相同)。HPLC纯度检测结果采用面积归一化法,提取228nm的色谱图所得的供试品溶液中总杂质含量为0.20(为了检验数据的保密性,给出的数值是参考值),其中最大杂质的含量为0.2(为了检验数据的保密性,给出的数值是参考值)。

  环扁桃酯TLC法检查纯度薄层色谱条件:硅胶GF嘲板为薄层板,正己烷一乙酸乙酯一冰醋酸(8:2:1,v/V)为展开剂,在紫外光灯(254nm)下检视[6]。TIc纯度检测结果供试品显1个杂质斑点,其大小、颜色与4对照溶液相当(为了检验数据的保密性,给出的数值是参考值)。

  杂质检测结果采用不同的色谱方法,结果差异比较大。分析原因:主要是杂质的检测波长的选择导致结果的差异性。在HPLC纯化中,将检测波长设定为254nm,采用面积归一化法,供试品溶液中总杂质含量为4.34(为了检验数据的保密性,给出的数值是参考值),其中最大杂质的含量为4.1%(为了检验数据的保密性,给出的数值是参考值),且该杂质在254nm的波长处有最大吸收。结果与TLC检测结果不谋而合。笔者提取228nm波长处环扁桃酯及杂质的吸收情况,根据其响应因子,确定228nm为环扁桃酯的有关物质的检测波长。可见检测波长的选择在HPLC有关物质检测中的重要性。

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  5讨论

  笔者在对乙酰谷酰胺HPLC纯度标化试验中发现:首先,色谱柱的类型、填料的性质及封尾情况对色谱峰的峰形有很大的影响;其次,考虑到溶剂的截止波长,调节DAD扫描波长范围;再次,考虑流动相的组成成分比例的变化、柱温、流速、进样量的选择。可见在色谱峰的纯度检测中影响因素较多,建议要综合考虑这些影响因素。

  在HPLC法进行含量测定或者TLC鉴别时,为提高方法的灵敏度,降低干扰,往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长,由于有关物质检查的对象是杂质,若将主药的最大吸收波长确定为检测波长,则杂质在此波长下的吸收可能偏低,某些杂质甚至无吸收,这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检,从而不能反映产品的真实质量,影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。

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