摘要：采用一种同时检测13种麻痹性贝毒的超高效液相色谱-串联质谱法，对沿海7省的贝类产品进行分析。目标物采用1Q乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱净化，氨基柱分离，多反应监测模式检测，外标法定量#方法检出限为4〜14#g/kg，回收率为60〜105%，日内和日间相对标准偏差分别为3!16Q和5〜17%(n=3"所检6种99批次的贝类产品中，麻痹性贝毒在贻贝、泥蚶、毛蚶、扇贝中检出率分别达38.89%、23.53%、23.08%、1667Q，其毒力水平在669!1635.5#gSTXeq/kg之间。
关键词：贝类产品麻痹性贝毒固相萃取超高效液相色谱-串联质谱法
麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisonings，或其孢子，经食物链蓄积、转化生成的一类四氢曝PSP)是由海洋中贝类通过非选择性滤食有毒海藻呤衍生物[1]。在多种贝类毒素中，PSP危害最大、发生频率最高、分布范围最广，严重威胁人类健康2#联合国卫生组织规定贝类可食用部分的PSP含量不得超过800#gSTXeq/kg[3]。
相关期刊推荐：《分析仪器》(双月刊)创刊于1970年，由中国仪器仪表行业协会和北京分析仪器研究所(北京北分仪器技术公司)主办，国内外公开发行。本刊主要反映分析仪器和仪器分析技术的发展动态;报导分析仪器科研成果、新型仪器和仪器的改进;探讨分析仪器和仪器分析的有关理论;推广分析仪器的应用技术;交流分析仪器使用和维修经验;介绍分析仪器和仪器分析方法的基础知识等。
目前PSP测定方法主要有小鼠生物法、ELISA法、细胞毒性测试法、毛细管电泳法[4]、液相色谱法[5]和液质联用法[6]。小鼠生物法无法定量毒素组分，ELISA法易产生假阳性，细胞毒性测试法难以迅速普及，毛细管电泳法适用性有限，液相色谱法前处理复杂。液质联用法可同时提供定性定量信息，已广泛应用于动物及环境中PSP的监测。本研究以超高效液相色谱-串联质谱法(ultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,UPLG-MS/MS)为分析手段，对沿海省份6类共99批次贝类产品中13种PSP进行了监测，为了解PSP在食用贝类中的污染和分布情况提供数据支持。
1材料与方法
1.1材料与试剂
扇贝、贻贝、牡蛎等贝类产品，购买于沿海各省市的流通市场和养殖区;PSP标准品购买于加拿大海洋生物科学研究所;乙酸：优级纯，上海国药集团;氨水：色谱纯，上海沃凯生物技术有限公司;乙腈：色谱纯，德国Meker公司;甲酸：色谱纯，上海国药集团。
12仪器与设备
ACQUITY超高效液相色谱-质谱仪(美国Wa ter公司);石墨化碳黑固相萃取柱(250mg/3mL,美国Supelco公司);Centrifuge5810高速离心机(德国Eppendorf公司)。
13方法
1.3.1样品处理
样品前处理参考文献[7]:称取5g均质试样于50mL离心管中，加人5mL1Q乙酸水溶液，涡旋混合90s，密封置于沸水浴5min，取出于流水冷却至室温。混合物4500r/min离心10min,取上清液1mL于2mL离心管中，加人5#L氨水，涡旋混匀后10000r/mtn离心5mtn。
依次用3mL乙腈、3mL20Q乙腈水溶液(含1Q乙酸)、3mL0.1Q氨水溶液活化石墨化碳黑固相萃取柱，500#L提取液上样，700#L超纯水淋洗，最后用1mL75Q乙腈水溶液(含0.25Q甲酸)洗脱收集于2mL离心管中。洗脱液过0.22#m滤膜于进样小瓶中，4°C下保存，供UPLC-MS/MS分析。
1.3.2超高效液相色谱条件
色谱柱：AcquityUPLCBEHAmide(2.1X100mm，1.7#m)流动相A:水/甲酸/氨水(500:0.075:0.3，v/v/v)，流动相B:乙腈/水/甲酸(700:300%.1，v/v/v);梯度洗脱程序：0〜2.0min，4%A;2.0〜4.0min,4〜30%A;4.2〜6.0min,30〜65QA;6.2〜8.0min,65〜4%A;柱温40°C;样品温度4°C;进样体积10#L;流速0.4mL/min。
1.3.3质谱条件
质谱条件：电喷雾离子(ESI)，多反应监测(MRM)，正负离子切换模式;离子源温度150C;脱溶剂气温度600°C;脱溶剂气流量1000L/h;锥孔气流量150L/h。其中STX、NEO、dcSTX、dcNEO采用ESI+，毛细管电压1.OkV，锥孔电压10V;其他目标物采用ESI，毛细管电压2.7kV;锥孔电压40V;定性、定量离子对及其他参数见表1。
2结果与分析
2.1超高效液相色谱-串联质谱法
PSP属于强极性化合物，其中C1与C2、GTX1与GTX4、GTX2与GTX3、dcGTX2与dcGTX3互为同分异构体。本法前处理参考吴海燕等[7]，样品采用1%乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱净化(旦目标物经氨基柱分离，MRM模式检测。吴海燕采用TSK柱对PSP进行洗脱，保留时间在5.85到6.17min之间;本文利用流动相的酸碱度变化，结合梯度洗脱，可在8min内实现13种PSP的有效分离，保留时间在1.97到4.74min之间，具有可比性。
方法采用空白基质制作标准曲线，13种目标物在4!722ng/mL线性范围内相关系数均大于0.996,检出限为4!14#g/kg。方法回收率为60!105%，日内和日间相对标准偏差(RSD)分别为3!16Q和5!17%(n=3)。本方法灵敏度、回收率与精密度良好，适用于各种贝类产品中PSP的检测(表3)。
2.2沿海贝类中麻痹性贝毒的监测情况
对沿海六省一市采集的99批次贝类产品进行分析，共检出PSP阳性样品17批次(图1)，分布于浙江、江苏、辽宁三省，其检出率分别为46.67%、35.71%、33.33%。孙烨]统计2000~2015年PSP食品中毒事件，发现浙江省中毒案列高于其他各省，与本结果基本相符。
比较采样时间(图2)对PSP检出率的影响，发现6月检出率高达68.75%，7月和9月检出率在18.75%~21.43%间。夏秋两季是赤潮的高发季节，贝类滤食有毒藻类的几率增加，PSP检出率随之增加。本次调查的贝类产品覆盖面广，采集时间较为分散，后期应合理增加采样频次，以便全面评价不同贝类中PSP的安全风险。
由图3可见，6种贝类产品中共有4种贝类产品中有PSP检出，始贝、泥蜡、毛、扇贝检出率依次降低，分别为38.89%、23.53%、23.08%、16.67%。如表4所示，17批次阳性贝类的PSP含量在66.9〜1635.5冲3丁乂叫/1^之间，其中3批次泥蚶的PSP含量超过了联合国卫生组织的安全限值。图S为阳性泥蚶样品和混合标准品中13种PSP的定量MRM色谱图。
2.2阳性贝类中麻痹性贝毒的分布情况
PSP中STX毒性最高，其他多种毒素均通过转换成STX当量来表示;NEO的毒力仅次于STX，这两种毒素是PSP监测的重要指标[9]。本次监测发现在13种PSP中STX、GTX5和dcSTX的检出率较高，分别达到72Q&1Q和71%，而NEO的检出率为41Q，与之前文献报道基本一致[9’10]。
通过毒性转化公式将阳性样品中的各毒素统一转换为STXeq，并计算其在总毒素(1STXeq)中所占的百分比(图5)。从毒素组成分析来看，阳性毛蚶中PSP主要以STX(58〜88%)形式存在，还有少量的dcGTX3、GTX5和GTX3(均<5%);其中2批次样品还含有一定量的dcSTX(11Q和36%)。阳性泥蚶中PSP主要以dcSTX(43〜75%)、STX(12-22%)为主，此外还含有微量的01、〇2(均<7%)其中有2批次含有少量GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX3(均<10%)。阳性扇贝中PSP以GTX5(31〜38%)、STX(34〜38%)为主要存在形式，同时含有微量dcSTX(均<6%)其中2批次样品中GTX4的含量分别达到21%和25%。
在7批次的阳性贻贝中，PSP存在形式差异较大，其中1批次样品仅含有C1一种毒素;1批次样品含有3丁乂(50%)、〇丁乂1(29%)、4瓦〇(18%)及微量GTX2(3%)2批次样品特征相似，主要以C2(25%和26%)、dcSTX(24和25%)和NEO(20%和25%)为主，此外还含有微量GTX2、GTX5、dcGTX3、STX(3-9%);1批次样品主要含NEO(30%)、GTX3(20%)、dcSTX(18%)和dcGTX3(10%)，及微量C1、GTX2、GTX5、STX(2〜8%);1批次样品以NEO(67%)和GTX3(15%)为主，同时有少量C1、GTX2、GTX5(总比<18%);1批次样品主要以dcGTX3(28%)、C1(25%)、GTX1(23%)、GTX5(19%)形式存在，及少量dcGTX2(5%)。
3结论
采用UPLC-MS/MS方法进行了沿海贝类产品中13种PSP的定性定量分析，本方法灵敏度高、分析速度快、重现性好，可广泛适用于各类贝类产品中麻痹性贝毒的检测。
