摘要：对手性药物的分析一直是药学领域的一个研究热点，近年来各种检测新方法也不断应用于手性药物的分析中。本文主要介绍了近十年来手性药物的检测方法。比较目前已有的手性药物检测方法的优势与不足，并对手性药物检测方法的发展趋势进行了展望。
关键词：手性药物对映异构体手性检测综述
1前言
手性药物即在药物分子结构中引入手性中心所得到的一对互为镜像与实物的对映异构体。目前，临床上使用的药物约有三分之一是手性药物。在药代动力学方面，手性药物也可能在体内的吸收、分布、代谢和排泄中表现出一定程度的立体选择性。因此手性药物的检测在新药研发、活性化合物筛选和药物检验中均十分重要。本文就手性药物的检测方法进行综述。
2手性药物的检测方法
近年来各种检测新方法不断应用于手性药物的分析中，包括旋光法(polarimetry)和旋光色散法(opticalrotationdispersionmethod，ORD)、圆二色性法(电子圆二色性法electroncirculardichroism，ECD、振动圆二色性法vibrationcirculardichroism，VCD)、手性拉曼光谱法(Ramanopticalactivity，ROA)、质谱法(massspectrum，MS)、核磁共振法(nuclearmagneticresonance，NMR)，电化学法(Electrochemical)、光学传感器等。
2.1旋光法和旋光色散法
旋光法(polarimetry)一直是人们最常用来检测手性分子的方法，以其操作简单、检测价格低而极受欢迎，也是现在《中国药典》中广泛使用的方法。虽然影响因素较多，包括温度、检测光波长、样本杂质等，但其在一定条件下满足手性分析基本需求。在实验中通常以光学纯度来对样品进行分析。通常将供试品在钠光谱D线处的旋光度与相同条件下同种纯品旋光度的比值定义为光学纯度(opticalpurity，O.P)，其值某种意义上反映了供试品纯度。戴月华等人[1]用旋光法测定硫酸西索米星氯化钠注射液中西索米星的含量。郝玲花等人[2]用旋光度法测定布洛芬注射液中精氨酸的含量，主药布洛芬不干扰精氨酸测定。杨振林等人[3]用旋光法测定氯霉素滴耳液中氯霉素的含量。董杰[4]用旋光法测定盐酸地尔硫卓原料及片剂中盐酸地尔硫卓的含量。
旋光色散法(ORD)则可从多个波长更全面的角度对供试分子进行分析，在分子绝对构型的判断和医学诊断上发挥重要作用。而如何改进仪器，从而快速准确的得到旋光度成为研究的焦点，这将推动旋光色散仪的发展。JiangShixin等[5]提出使用CCD来测量旋光度，这使得旋光色散法的检测时间大大缩短、准确度大大提高并且为旋光色散仪的改进提供新的思路。
2.2圆二色性法
圆二色性(circulardichroism，CD)早在19世纪就被发现，但由于其信号响应绝对强度过小等原因导致其实验仪器在20世纪50、60年代才出现。而对于圆二色性信号的放大的问题尚未完全解决。
2.2.1电子圆二色性
手性分子的圆二色性最初在紫外波段被发现，因分子对紫外吸收主要反映出分子电子能级跃迁的情况，故称为电子圆二色性法(ECD)，而现在圆二色性多指在紫外-可见波段出现的圆二色现象。圆二色性法较旋光法更为灵敏、准确、可靠，受到外界影响较小。在圆二色性法中，对映体纯度常用对映体过剩率(ee)表示：ee=(CR-CS)/(CR+CS)，CR和CS分别为R和S体浓度。经理论与实验证明，圆二色性法可测得样本ee值，并与手性色谱拆分的结果相似。圆二色性法可在不进行手性拆分的条件下进行对映体纯度分析，较传统的色谱而言更加简便、快速。MacduffO.Okuom等[6]在不借助高效液相色谱的条件下利用圆二色性法对手性药物的纯度分析，对布洛芬、雅维等药物的测得效果较好，并认为其将成为一种绿色的手性药物测定方法。由于电子圆二色性法(ECD)反映了电子的性质，因此也广泛的用于分子绝对构型的预测[7]。张林群等人[8]分别用圆二色光谱仪和旋光仪对右旋葡萄糖和左旋硫酸奎宁进行比旋度检测。研究表明，无论是右旋还是左旋化合物，两种方法测定的结果相近，相对误差小于5%。但用圆二色光谱仪检测的线性范围要比旋光仪法宽10倍，检出限低一个数量级，稳定性更好。他们进一步对原料药哌拉西林钠和他唑巴坦用圆二色光谱仪法进行比旋度的检测，结果均与中国药典吻合。但用圆二色光谱法不仅样品用量少，而且能获得200～600nm范围内样品旋光度的变化趋势，从而能对样品的旋光性进行全面研究，并且能进行单波长、多波长和连续波长的旋光检测。圆二色光谱法操作便捷、准确、灵敏，有较好的实用性。
2.2.2振动圆二色性法
振动圆二色性法(VCD)指物质对左右圆偏振红外光吸光度的差值，是振动光活性(Vibrationop-ticalactivity，VOA)中较早得以运用的技术[9]。红外脉冲发射器的使用与改进使得振动圆二色性法的检测时间降至皮秒、飞秒，甚至可检测出蛋白质等分子在溶液中的结构变化，被认为是解析香料、金属配合物、生物大分子等手性分子结构最常使用的方法[10，11]。振动圆二色性法主要用于分子绝对构型的测定，而Quesada-MorenoMM等人[12]首次利用振动圆二色性法用于定量分析，测出樟脑的ee值，这将为振动圆二色性法用于药物含量测定提供了新的用途。虽然现在单独利用振动圆二色性法可预测结构，但往往出现错误，故在解析分子绝对构型时应结合多种方法，综合后给出答案[13]。
2.3手性拉曼光谱
手性拉曼光谱法(ROA)指物质在拉曼散射截面上对左右圆偏振光散射强度差值。手性拉曼光谱法较振动圆二色性法运用晚，激光光源的使用解决了信号强度过弱的问题。SimmenBenjamin等人[14]通过氘原子、氟原子、甲基的衍生化实验推断出手性拉曼光谱法可识别2433个手性中心，而后有人提出手性拉曼光谱法的强度信号较位移信号更重要的想法，并提出了相应的算法[9]，为使用手性拉曼光谱法解析、预测结构提供了新的启示。由于其可定性、定量的进行手性分析并且样本可回收等特点，故手性拉曼光谱法多用于体内活性分子的分析，例如BelenNieto-Ortega等[15]利用手性拉曼光谱法测定体内抗血管生成素类分子，为新药开发等方面提供启示。贾国卿等人[16]以葡萄糖酸内酯的碱性水解为模型反应，利用手性拉曼光谱，从分子振动的角度讨论了葡萄糖酸内酯水解前后的手性变化行为。赵彦牧等人[17]从旋光拉曼(Ramanop-ticalactivity，ROA)谱的峰强，求取了手性分子反-2，3-环氧丁烷的旋光拉曼键极化率。由分子手性中心的C-H产生的偶极矩与拉曼激发过程中，电荷流动产生的跃迁磁偶极矩的耦合，来理解旋光拉曼活性产生的机理。王鹏等人[18]利用自主搭建的457nm短波长手性拉曼光谱仪对三磷酸腺苷(ATP)在酸性(pH=2.0)和中性(pH=7.0)水溶液中的手性结构进行了研究。通过拉曼和手性拉曼光谱图的分析，发现在不同的pH条件下，拉曼光谱表现出了明显的差异，但在相应的手性拉曼光谱图中，光谱轮廓具有极大相似性，主要的差别反应在950～1150cm-1光谱区域，说明pH值的改变，主要影响了环外磷酸基团和呋喃糖环之间的相互作用方式。
2.4质谱法
质谱法(MS)被认为只能提供分子质量与官能团的信息，而手性药物具有相同的分子质量，相似的结构，而无法通过MS区分[19，20]。而随着新技术的成熟与发展，使得MS的灵敏度和特异性大大提高，并且软电离源的使用使得动力学方法分析手性药物成为可能，并在对映体间制造差异的条件更为多样[21]。常用的方法包括两类，一类为将MS连接在有手性分离能力的装置之后成为一个高灵敏的检测系统，比如在手性色谱后连接MS[22，23];另一类为直接利用MS直接进行手性识别。后者具有快速、灵敏度高、专属性强等优点，且不需要复杂的前处理或衍生化，不受检测试剂或溶剂的干扰，并具有潜在的高通量检测能力[24]。
本文主要介绍利用质谱直接进行手性识别。按其原理可分为四类，分别为：(1)非对映异构体配合物解离法，指根据对映体与手性选择试剂结合后复合物稳定性不同而实现手性分析;(2)手性离子迁移质谱，对映物与手性选择试剂结合后电迁移性质出现差异而得以区分;(3)主客体法，指根据对映体与手性选择试剂的亲和力不同导致结合物的相对丰度不同而进行分析;(4)客体交换离子/分子反应法，指根据对映体与手性选择试剂结合存在动力学差异而进行手性分析。本文主要介绍较常用的非对映异构体配合物解离法与手性离子迁移法。
2.4.1非对映异构体配合物解离法
非对映异构体配合物解离法(collision-induceddissociationofdiastereomericcomplex)是针对手性分子和手性配体形成的非对映异构体配合物，以串联质谱的碰撞诱导裂解为基础而建立的方法。通常采用二价过渡金属离子与手性识别试剂物及分析物形成三元四配位配合物离子并通过碰撞诱导解离使其裂解，由于对映体之间的空间构型不同，配合物离子中结合的牢固程度也不同，导致在质谱图上裂解产物的离子丰度不同，据此可对样品的手性进行识别。根据对映体复合物自由能变的差值可判断其手性识别的能力。而动力学方法的手性选择性和手性识别能力与分析物和手性试剂的相对浓度无关、易于定量分析、对杂质的高度耐受性无需提纯、无需使用同位素标记试剂、更容易制成商业仪器等诸多优点而广泛使用，但其手性选择性仍然需要提高。WuLianming等人[25]利用动力学质谱对一种含硼抗生素进行定量分析。耿颖等人[26]使用电喷雾质谱技术，研究3种氨基酸(D-赖氨酸、L-谷氨酰胺和L-酪氨酸)作为手性选择探针对格列美脲和格列美脲异构体的识别效应，首次实现了格列美脲和格列美脲顺式异构体的质谱法快速识别。戴田行等人[27]采用质谱技术，利用手性探针酰氯对盐酸兰地洛尔及其3个立体异构体进行了区分识别研究，采用两个手性酰氯探针N-对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯(TSPC)和(-)-莰烷酰氯与盐酸兰地洛尔反应产生共价结合产物，放大了盐酸兰地洛尔与其立体异构体的结构差异。吴若菲等人[28]利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)研究了18-冠醚-6和20种天然氨基酸之间的非共价相互作用。结果表明，18-冠醚-6与氨基酸能形成化学计量比为1∶1的非共价复合物。冠醚主要通过与氨基酸上的NH2配位而与其结合，故在L型氨基酸中，侧链为烷基(或氢原子)的氨基酸、碱性氨基酸对冠醚的亲和性更强。同时，实验也表明冠醚仅能识别部分中性氨基酸及其异构体。MartaCal等人[29]使用一系列β-氨基异羟肟酸和组氨酸异羟肟酸的衍生物，通过MS/MS实验证实了所研究的超分子体系在气相中的高稳定性。还研究化合物的碎裂途径，得到的结果表明三元12-金属催化-4的形成过程不是选择性的，各种结构和手性的配体可以结合到这些系统中。
2.4.2手性离子迁移质谱
手性离子迁移质谱(ionmobilitymassspec-trometry)是一种气相分析方法，基于被检测离子的大小与形状[30]。离子迁移质谱仪和普通质谱仪相类似，相比之下多了离子迁移池，其本身也不具有手性识别功能，但由于手性分子与检测试剂形成配合物，而配合物的结构差异导致其在离子迁移池电场下的碰撞截面和运动行为产生差异，从而区分异构体[31]。主要采用三种离子迁移技术：时间离子迁移谱、行波离子迁移谱和场不对称离子迁移谱。阿替洛尔、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、糖类、葡萄糖、青霉胺、缬草酚、苯丙氨酸和色氨酸等均可通过离子迁移质谱从他们的消旋体中分离检测[32]。在特布他林对映体的检测实验中，与高效液相色谱和毛细管色谱相比，场不对称离子迁移质谱检测限更低(可达0.1%)、样品分析时间更短[33]。手性离子迁移质谱具有识别多个手心中心的能力，较普通的色谱法更加灵敏、快速，并具有一定的定量分析能力，在手性分析方面有一定的发展潜能。
2.5核磁共振法
由于对映体的结构十分相似，故互为对映体的两种化合物的信号难以直接通过核磁共振谱区分，但对映体处于不对称环境中，形成非对映异构关系时可能产生化学位移的不等价，从而使相应基团的信号分开。
核磁共振法(NMR)技术分析对映体纯度主要通过两种方法来实现：(1)使用手性试剂与对映体反应，使之转化为一对非对映体并比较非对映异构体的信号，即衍生化法;(2)在对映体混合物中加入手性溶剂或者手性位移试剂，提供一个外部非对映环境。这两种方法均利用非对映体相应基团的信号产生不同的化学位移，使信号分开。并通过信号强度可求出其ee值。现在利用NMR测定ee的方法主要有三种：手性衍生化试剂法、手性溶剂化试剂法、手性位移试剂法。由于手性位移试剂法造价较高，不易回收等缺点难以大规模使用，故此处不做叙述。
2.5.1手性衍生化试剂法
手性衍生化法(chiralderivation)是一种简单高效的方法，一次可分析多个手心中心[34]。首先通过衍生化试剂将样品转化为相应的非对映体，然后利用核磁共振信号的不同加以分析。最常用的手性衍生化试剂为MTPA和Mosher试剂。KellyAM等人[35]报道了一种通过多组分反应来测定手性胺对映体纯度的方法，较为准确，时间较少。Sabot等人[36]报道了一种通过多组分反应来测定手性胺ee值的试剂CDA-1，其与胺类化合物反应，衍生化条件温和、不需要分离纯化可直接进行19FNMR。TickellD.A[37]报道了一种简单实用的三组分手性衍生化方法，用1HNMR波谱分析测定手性羟胺的对映性，包括用2-甲酰苯基硼酸和消旋的联二萘酚处理，得到非对映体硝基-硼酸酯混合物并用1HNMR直接进行分析可准确反映母体羟胺纯度。
2.5.2手性溶剂化试剂法
手性溶剂化试剂(chiralNMRsolvent)通过非共价相互作用与所研究的手性化合物相结合，而其识别手性结构的原理可能是在溶液中，手性溶剂与底物的配合物可能具有不同的化学位移，而由于对映体与溶剂中组分的结合力不同导致他们的溶剂环境不同也可引起不同的化学位移[38]。ThomasP.Quinn等人[39]报道了一种新的氮杂冠醚，用来测试手性扁桃酸系列衍生物的ee值，位移值最大达到0.13×10-6，误差在1%以内。Redondo等[40]采用NMR对平喘药物孟鲁司特进行了手性分析，并考察了9种不同的手性溶剂的分离效果，即D-二苯甲酰基酒石酸、D-二甲苯甲酰基酒石酸、(+)-樟脑酸、S-联萘酚、S-3，3′-二苯基-2，2′-联萘-1，1′-二醇、R-3，3′-二-9-蒽基甲氧基-1，1′-联-2-萘酚、R-3，3′-二-9-菲基-1，1′-联-2-萘酚、Pirkle醇和(-)-辛可尼丁。实验结果发现，大部分溶剂都能使孟鲁司特形成非对映异构体，可检测R-型异构体中S-型杂质的含量;就NMR手性识别能力和实验条件的简易性而言，(-)-辛可尼丁作为手性溶剂较为合适。
2.6电化学法
电化学传感器具有仪器微型化、操作方便快速、在线、实时、低成本、灵敏度高、环保等优点。将手性识别与电化学方法结合形成的手性电化学传感器通过不同的电化学技术(例如循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)、电化学交流阻抗技术(EIS)等)研究手性选择剂与目标手性分子间相互作用后电化学信号的差异[41]。电化学手性传感器的基础是构建导电性良好的手性界面，识别不同手性物质时，需选择适当的手性识别材料，常用的手性识别材料有蛋白质、DNA、氨基酸及其衍生物、人工高分子聚合物、手性超分子化合物以及手性金属配合物[42]。由于电化学手性传感器具有快速、灵敏、操作简单的优点，基于碳纳米材料的手性电化学传感器引起了广泛的关注，常见的有石墨烯，碳纳米管，石墨烯量子点等[43]。
马骄等人[44]选择β-环糊精(β-CD)作为手性选择剂，将其滴涂到经金铂纳米合金与还原氧化石墨烯复合材料(Au-PtNPs/rGO)修饰的玻碳电极表面，得到β-CD/Au-PtNPs/rGO修饰电极，采用差分脉冲伏安法(DPV)研究该修饰电极与酪氨酸对映体(D-或L-Tyr)的相互作用。实验结果表明，修饰电极可分别与D-或L-Tyr作用，并呈现不同的电流响应，其中与L-Tyr作用后的峰电流值明显高于D-Tyr。张亚会等人[45]采用滴涂方式将羧酸化多壁碳纳米管(f-MWCNTs)修饰于玻碳电极(GCE)表面成膜，然后恒电位法在上述修饰电极表面电沉积壳聚糖(CS)膜，形成CS和f-MWCNTs复合膜修饰电极(CS/f-MWCNTs/GCE)，并用于色氨酸(Trp)对映异构体的手性识别。张金萍等人[46]设计合成了一种石墨烯/壳聚糖复合物薄膜，并将其作为电化学电极应用于选择性检测具有旋光活性的色氨酸(Trp)对映体。轩春芝等人[47]将牛血清白蛋白(BSA)自组装在经电沉积纳米金修饰的玻碳电极表面，构建了简单的电化学手性传感界面，并讨论了该界面与不同浓度范围的抗疟疾手性药物奎宁和奎尼丁的相互作用。采用差分脉冲伏安法(DPV)和紫外-可见分光光度法(UV-Vis)测试了BSA与奎宁、奎尼丁之间的选择性作用。陈翠等人[48]将氯铂酸与L-缬氨酸按一定比例混合，通过循环伏安法在玻碳电极表面电沉积形成铂掺杂L-缬氨酸聚合膜，“一步”构建一个简单的手性传感平台，以普萘洛尔自身为氧化还原探针，采用差分脉冲伏安法研究了该手性传感平台与普萘洛尔对映异构体之间的相互作用。
相关期刊推荐：《环境工程学报》以研究报告和学术论文为主，突出学术性与技术性，亦刊登少量高水平的特约综述读者对象主要为：环境工程与环境科学领域的科研人员、技术研发人员、各级环保管理人员、环保企业以及大专院校师生等。主要栏目有：水污染防治、大气污染防治、土壤污染防治、固体废物处理与资源化、工程应用实例、相关研究。
3展望
随着科技的进步，对手性药物分析提出了更高的要求。随着物理学、材料学及相关技术的发展，利用手性传感器对药物进行手性分析成为可能。将可通过传感器直接获得供试物手性信号，并进行手性分析。与传统的手性纯度检测方法相比，手性传感器可简单、高效、实时检测混合物中对映体的相对含量。此外，纳米结构光学传感器是一个重要的发展方向之一[49]。段鹏飞及其合作者创新性地改进了圆偏振发光的测试方法，实现了各种不透明、非均相和薄膜体系的圆偏振发光测试，提出并验证了“上转换圆偏振发光”这一新的概念，实现了上转换圆偏振发光的测试;同时研究了手性超分子体系中手性信息和激发态能量转移迁移，以及激发态能量与手性信息的交互，发现手性组装体系中能量转移可以增强发光不对称因子glum这一重要规律[50-54]。这些成果一方面拓展了圆偏振发光的测试方法，另一方面也拓宽了圆偏振发光在超分子化学研究领域的应用。尤其为具有上转换发光性质的手性材料的研究提供了有效的表征手段，可用来研究手性信息和激发态能量的转移传递规律，为分析化学、光化学与物理、材料化学、手性科学等研究提供新的研究思路。将圆偏振发光与上转换发光的概念交叉结合，新的发光现象和新检测手段为生物光学成像提供新的方法和途径，为开展圆偏振发光应用提供新的思路。
