摘要: 泛素化修饰是真核生物细胞内重要的翻译后修饰类型，通过调节蛋白质活性、稳定性和亚细胞定位广泛参与细胞内各项信号传导与代谢过程，对维持正常生命活动具有重要意义。组蛋白作为染色质中主要的蛋白成分，与 DNA 复制转录、修复等行为密切相关，是研究翻译后修饰的热点。DNA 损伤后，组蛋白泛素化修饰通过调节核小体结构、激活细胞周期检查点、影响修复因子的招募与装配等诸多途径参与损伤应答。同时，组蛋白泛素化修饰还能调节其他位点翻译后修饰，并通过这种串扰(crosstalk)作用调节 DNA 损伤应答。本文介绍了组蛋白泛素化修饰的主要位点和相关组分(包括 E3 连接酶、去泛素化酶与效应分子)，以及这些修饰作用共同编译形成的信号网络在 DNA 损伤应答中的作用，最后总结了目前该领域研究所面临的一些问题，以期为科研人员进一步探索组蛋白密码在 DNA 损伤应答中的作用提供参考。
关键词: 组蛋白;泛素化修饰;DNA 损伤应答;串扰
DNA 是真核生物遗传信息的载体，其遗传保守性是维持物种相对稳定的基础。然而，各种内源性或外源性因素造成的 DNA 损伤如不能及时修复，将导致细胞凋亡甚至癌变。因此，生物体在进化过程中形成了复杂的 DNA 损伤应答 (DNA damage response, DDR)机制，以应对各种 DNA 损伤压力。组蛋白是真核生物染色质中主要的蛋白成分，包括 H1、H2A、H2B、H3 和 H4 五种类型。约 146 bp 的 DNA 通过左手螺旋的方式环绕由 2 分子 H2A-H2B 二聚体和 1 分子 H3-H4 四聚体组成的核心颗粒 1.75 圈，形成核小体辅助 DNA 折叠[1,2]。
组蛋白 N 端含有大量精氨酸、赖氨酸残基，是主要的翻译后修饰位点。组蛋白在各修饰酶、去修饰酶共同编译下形成组蛋白密码(histone code)，构成了 DDR 中精密的信号网络[3]。近年来，组蛋白泛素化修饰在 DDR 中的作用愈发受到关注。组蛋白泛素化修饰可以通过调节核小体结构、激活细胞周期检查点、影响修复因子的招募与装配等途径参与 DDR。此外，组蛋白修饰之间还存在交互作用，一位点修饰能促进或抑制其他位点的修饰[4,5]。组蛋白泛素化修饰同样可以通过这种串扰(crosstalk)作用调节其他类型翻译后修饰作用于 DDR。本文介绍了组蛋白泛素化修饰的各主要位点和相关的 E3 连接酶、去泛素化酶与效应分子，以及这些修饰作用共同编译形成的信号网络在 DDR 中的作用。
1 泛素与泛素化修饰
泛素(ubiquitin, ub)是由 76 个氨基酸组成的多肽，广泛存在于真核生物体内。泛素分子高度保守，在动物、植物和酵母菌中其一级结构仅有 1~3 个氨基酸残基不同，三级结构基本相同[6]。泛素分子在激活酶(E1)、结合酶(E2)和连接酶(E3)的作用下连接于底物，形成单泛素化修饰。泛素分子还可依次连接于前一泛素分子的赖氨酸或甲硫氨酸残基形成泛素链，称多聚泛素化修饰。连接位点有第 6、11、27、 29、33、48、63 位赖氨酸残基和第 1 位甲硫氨酸残基(K6/11/27/29/33/48/63-linked and M1-linked) 8 种类型。
泛素化修饰是泛素–蛋白酶体途径(ubiquitinproteasome pathway, UPP)的重要步骤，介导了细胞内短寿蛋白和错误折叠蛋白通过 26S 蛋白酶体降解。此外，泛素化修饰还能调节蛋白在细胞内的定位与活性，广泛参与 DNA 复制转录、损伤应答、炎症反应、免疫应答、细胞周期与凋亡、囊泡运输等诸多生理过程[7~11]。不同的效应往往与泛素链不同的拓扑结构有关，例如 K11/48 连接的泛素链主要参与蛋白质降解，K63 连接的泛素链主要参与 DNA 损伤应答与信号转导，而 M1 连接的泛素链则主要参与免疫应答与炎症反应[12]。
2 H2A 多位点泛素化修饰参与 DDR
H2A 泛素化修饰最早于 1975 年发现，首个修饰位点定位于 K119 (第 119 位赖氨酸，同下)，后又陆续在 K13/15 和 K127/129 等位点发现泛素化修饰[13,14]。 H2A 各位点泛素化修饰介导多种生物学效应，对修复进程进行调控，在 DNA 双链断裂(double-strand breaks, DSBs)和紫外线造成的 DNA 损伤(UV-induced DNA damage)应答中起重要作用。
2.1 沉默损伤周围基因
哺乳动物细胞核内约 5%~15%的 H2A 处于单泛素化修饰状态，其中以 H2AK119 单泛素化修饰为主。 H2AK119 单泛素化修饰参与抑制 RNA Pol Ⅱ延伸、多梳蛋白家族(polycomb group proteins, PcG)基因沉默、X 染色体失活和抑制趋化因子基因表达等诸多生理过程 [15~17] 。多梳抑制复合体 1 (polycomb repressive complex 1, PRC1)是 PcG 家族成员，其亚基环指蛋白 2 (ring finger protein 2, RING2)是单泛素化修饰 H2AK119 的 E3 连接酶，通过第 98 位精氨酸残基嵌入 H2A-H2B 二聚体间缝隙定位催化反应。由于缺乏活性精氨酸/赖氨酸残基，RING2 还需与 PRC1 另一亚基 BMI-1 结合形成异二聚体才能充分发挥其催化活性。异二聚体形成有助于稳定 E2~ub 结构，促进泛素分子传递，BMI-1 缺失将严重影响 RING2 活性[18]。
H2AK119单泛素化修饰可与 PcG家族另一成员 PRC2 催化的 H3K27 三甲基化修饰相互串扰，即 PRC1 的 CBX 亚基识别 H3K27 三甲基化修饰定位，单泛素化修饰 H2AK119;PRC2 的 JARID2 亚基识别 H2AK119 单泛素化修饰定位，三甲基化修饰 H3K27[19]。这种交叉招募可极大地提高损伤位点附近 H2AK119 单泛素化修饰水平。
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近年来，已有关于RING2/BMI-1催化的H2AK119 单泛素化修饰参与 DSBs 修复的研究报道，如在损伤早期调节 γH2AX 生成、影响修复因子招募以及辅助 DNA 定位于核仁周围等，但具体机制尚未明确[20,21]。目前，H2AK119 单泛素化修饰在 DSBs 修复中较为明确的作用是实现损伤位点周围数千碱基对范围内基因沉默，抑制损伤区域的复制、转录行为，减少错误产物的生成，为 DNA 修复创造条件[22,23]。然而， Chandler 等[24]在 AsiSI 限制酶诱导的 DSBs 周围并未发现 PRC1 聚集，对上述理论提出挑战。此外，还有证据表明除参与 DSBs 修复外，细胞核内储备的 K119 单泛素化修饰的 H2A还可在分子伴侣 CAF-1的辅助下定位于 UV 损伤周围，并通过共济失调毛细血管扩张症 Rad3 相关蛋白激酶(ATM and Rad3 related kinase, ATR)依赖的途径参与核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)后染色质重塑[25,26]。
2.2 调节 DNA 断端剪切
同源重组修复(homologous recombination, HR)和非同源断端连接(non-homologous end joining, NHEJ) 是细胞修复 DSBs的两种重要方式。BRCA1和 53BP1 分别是 HR 和 NHEJ 中重要的效应分子，二者相互竞争，又彼此协同。BRCA1 通过易化 DNA 断端剪切，促进 HR;相反，53BP1 则在 DNA 断端两侧限制 DNA 剪切长度，防止过度剪切造成的 DNA 单链复性和染色体重排，易化 NHEJ。BRCA1 和 53BP1 在不同位点被招募并级联不同的后续效应，共同决定两种修复方式间的平衡[27](图 1A)。
环指蛋白 8 (ring finger protein 8, RNF8)和环指蛋白 168 (ring finger protein 168, RNF168)催化的 H2A/H2AXK13/15 泛素化修饰，是 BRCA1 和 53BP1 招募过程中的重要信号。RNF8 和 RNF168 的聚集，依赖于 ATM 和 DNA 损伤检测点介质 1 (mediator of DNA damage checkpoint 1, MDC1)的作用。ATM 检测到 DSBs 后，磷酸化修饰 H2AX 和 MDC1。磷酸化 MDC1 的 BRCT 结构域识别 γH2AX 定位于损伤位点，作为脚手架招募 RNF8[28,29]。早期认为由 RNF8 直接多聚泛素化修饰 H2A/H2AXK13/15 招募修复因子[30]，或首先由 RNF8 单泛素化修饰 H2A/H2AXK13/ 15 招募 RNF168，再由 RNF168 延伸 K63 连接的泛素链招募修复因子[31]。然而实验中发现 RNF8 在体内对核小体中 H2A/H2AX 缺乏亲和力，却具有延伸 K63 连接的泛素链的能力。近年来的研究对这一过程逐渐有了清晰的认识：RNF8 被招募至损伤位点后首先多聚泛素化修饰 H1(K63 连接的泛素链)招募 RNF168，由后者单泛素化修饰 H2A/H2AXK13/15，最后再由 RNF8 延伸 K63 连接的泛素链，招募修复因子[32,33]。
BRCA1 是 H2A/H2AXK13/15 多聚泛素化修饰招募的修复因子之一，实际上 BRCA1 与 RAP80、 Abraxas、MERIT40、BRCC36、BRCC45 和 BARD1 形成 BRCA-A 复合体共同被招募[34]。该复合体以 Abraxas为核心组装，RAP80负责识别泛素链定位[35]。 BRCA1-A 复合体能限制 DNA 断端剪切，防止 HR 过度激活[34]。去泛素化酶 BRCC36 清除 K63 连接的泛素链，被认为在该过程中发挥主要作用[36]。53BP1 是另一个被招募的修复因子，与 BRCA1 不同，53BP1 通过识别 H2AK15 单泛素化修饰定位[37,38]。53BP1 可在损伤位点与剪切酶竞争，调整 DNA 断端剪切长度。同时，53BP1 还可作为脚手架，促进修复因子组装[39]。BRCA1-A 复合体和 53BP1 的协同作用有效避免了 DNA 断端过度剪切，使细胞倾向于通过 NHEJ 途径修复 DSBs。
K127/129 单泛素化修饰是新近发现的第 3 个参与 DSBs 修复的 H2A 泛素化修饰类型，由 BRCA1-C 复合体催化。BRCA1-C 复合体包含 BRCA1/BARD1 二聚体、DNA 内切酶 CtIP 和 MRN 复合体 3 种成分， BRCA1 是主要的 E3 活性单位[40]。与 RING2/BMI-1 二聚体相似，BRCA1 需与 BARD1 结合才能充分发挥其催化活性[41]。BRCA1/BARD1 在异染色质蛋白 HP1 的辅助下定位至损伤中心区域催化 H2AK127/ 129 单泛素化修饰，后者可被 SMARCAD1 的 CUE 结构域识别[42]。SMARCAD1 依赖其 ATP 酶活性将 53BP1 重新定位于损伤外围，易化 CtIP 在 MRN 复合体辅助下剪切 DNA 断端，促进以高保真的 HR 修复 DSBs[41,43~45]。值得一提的是，BRCA1 还可形成 BRCA1-B/D 复合体，分别通过调节细胞周期和促进链侵入的方式参与 DDR[34]。
2.3 辅助起始 NER
除 RING2/BMI-1 外，H2AK119 单泛素化修饰还可由 DDB1-CUL4DDB2 复合体催化，辅助起始 NER[46]。NER 是应对 UV 造成的 DNA 损伤的主要方式，除修复环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs)和 6-4 光产物[(6-4) photoproducts, 6-4 PPs]外，NER 还可广泛地识别多种损伤，与其特殊的识别机制有关。XPC 是全基因组 NER 中主要的识别因子，可识别 DNA 发生修饰 ( 损 伤 ) 且 Waston-Crick 碱基配对破坏时形成的不稳定结构，而非损伤本身[47]。CPDs 本身不足以引起 DNA 螺旋结构的不稳定，因此还需 DDB1-CUL4DDB2 复合体的辅助才能激活 NER。该复合体由 E3 连接酶 CUL4 和紫外线损伤 DNA 结合蛋白(UV-damaged DNA-binding protein, UV-DDB)组成，其中 UV-DDB 包括 DDB1 与 DDB2 两种类型，DDB1 位于 CUL4 的 N 端，是连接 CUL4 与 DDB2 的桥梁。DDB2 通过 WD40 结构域识别 CPDs 后招募 DDB1-CUL4 至损伤位点[48]。正常情况下，CUL4 的活性受 COP9 信号体抑制，激活则依赖 NEDD8 类泛素化修饰[49]。
正常细胞在 UV 损伤后 H2AK119 单泛素化修饰水平迅速下降，DDB1-CUL4DD2 复合体在 H2AK119 单泛素化修饰水平的恢复中起重要作用。H2AK119 单泛素化修饰能有效促进 H2A/H2A-H2B 从核小体解离，加剧 DNA 螺旋结构的不稳定性，促进 XPC 识别[50]。同时，DDB2、XPC 均是 DDB1- CUL4DDB2 泛素化修饰的底物，DDB2 泛素化修饰后可被分子伴侣 VCP/p97 识别，介导 DDB2 通过 UPP 降解，解除位阻效应，促进后续 NER 进程[51,52]。XPC 泛素化修饰可增强其与 DNA 的亲和力，促进其与损伤 DNA 结合[52,53](图 1B)。
目前认为， DDB1-CUL4DDB2 单泛素化修饰 H2AK119 是发生在 NER 早期的事件，辅助 XPC 对损伤 DNA 的识别，激活 NER。RING2/BMI-1 单泛素化修饰 H2AK119 则更多的以剪切后事件的形式发生于 NER 后期，通过 CAF-1 和 ATR 依赖的途径参与染色质重塑[25,26]。
