摘要背景：课题组前期研究首次发现骨髓基质细胞可以分泌中性粒细胞趋化因子 3，且在骨髓基质细胞调控神经干细胞分化为神经元的过程中中性粒细胞趋化因子 3 的表达上调 1.5 倍，提示中性粒细胞趋化因子 3 可能具有促进神经干细胞增殖与分化的作用。目的：观察中性粒细胞趋化因子 3 对新生大鼠海马来源神经干细胞存活和增殖的影响。方法：体外分离培养新生 SD 大鼠海马神经干细胞，将培养 3 代的神经干细胞分为对照组和中性粒细胞趋化因子 3 组，通过 MTS 法检测细胞存活率，细胞生长曲线及活/死细胞染色观察细胞存活及增殖情况，通过免疫荧光染色法及 Real-time PCR 检测神经干细胞中 Nestin 的表达来观察神经干细胞增殖情况。结果与结论：①随着中性粒细胞趋化因子 3 质量浓度从 1 μg/L 增加至 20 μg/L，神经干细胞存活率逐渐增加，当质量浓度为 10 μg/L 时，神经干细胞存活率最高且细胞活力最好，再增至 20 μg/L 时，神经干细胞存活率无显著增加;②中性粒细胞趋化因子 3 组 Nestin 染色阳性率明显高于对照组(P < 0.05);③中性粒细胞趋化因子 3 组的 Nestin mRNA 表达量明显高于对照组(P < 0.05);④结果表明，中性粒细胞趋化因子 3 对海马来源神经干细胞具有促进存活和增殖的作用。
关键词：中性粒细胞趋化因子 3;海马;神经干细胞;细胞存活;细胞增殖;巢蛋白
0 引言 Introduction
神经干细胞是具有自我复制、分化能力的未分化细胞，在哺乳动物和人的大脑神经系统的发生和发展中，神经干细胞增殖分化为神经元和胶质细胞形成神经组织[1-2]，使之成为非常理想的细胞资源。大量实验证据表明，神经干细胞移植对于神经系统疾病及损伤等具有临床应用前景[3-6]。临床治疗神经系统疾病或损伤需要移植大剂量的神经干细胞，而神经干细胞体外培养过程复杂、增殖分化率低、移植存活率尚不乐观，这些仍是神经医学面临的严峻挑战[7]。因此，积极寻找有效的方法促进神经干细胞增殖将为临床细胞移植治疗提供重要的细胞来源。研究发现，神经干细胞的增殖分化极大程度上依赖于其生长的微环境，主要包括与神经干细胞相邻的支持细胞、细胞外基质、细胞因子及微血管网等[8-10]。限制哺乳动物中枢神经系统再生的原因并非是缺乏足量的神经干细胞，而是缺乏刺激神经干细胞分化 所 必需 的 细胞 因子 [11] 。中 性 粒细 胞 趋化 因子 3 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 3，CINC-3) 是含ELR的CXC类趋化因子，主要由激活的单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生[12]，它的生物学功能主要是在炎症反应中可以诱导白细胞的趋化作用，与受体CXCR2有高度的亲和力，该受体高度表达于中性粒细胞，促使它们黏附上皮细胞，通过血管壁迁移、组织入侵，产生氧自由基、脱颗粒和增加细胞内钙浓度，进一步扩大炎症反应[13-14]。在中枢神经系统中，CINC-3与其受体CXCR2结合可能产生抗凋亡、促进少突胶质细胞增殖和抑制其迁移的功能[15]，目前尚不明确CINC-3对神经干细胞和神经元的影响。该实验以体外扩增培养的新生SD大鼠海马神经干细胞为研究对象，通过CINC-3干预，探讨CINC-3对神经干细胞存活和增殖的影响。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2018年8月至2019年1月在河北医科大学第一医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 清洁级新生24 h内SD大鼠，雌雄不限，由河北医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号： SCXK(冀)2018-004。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
1.3.2 实验试剂及仪器 二氧化碳培养箱(美国NAPCO 公司，型号：5420-I);倒置显微镜(日本OLYMPUS公司，型号：IX70);正置荧光显微镜(日本NIKON公司，型号80i); DMEM/F12(1 ∶ 1) 培养液 ( 美 国 GIBCO 公 司 ， 型 号 ： C11330);碱性成纤维细胞生长因子(美国PeproTech公司，型号：96-400-29-50);B27 Supplement (美国GIBCO，型号：17504-044);Nestin鸡多克隆抗体(美国Abcam公司，型号：ab134017);RNA提取试剂盒(美国Promega公司，型号：LS1040);反转录试剂盒(美国Promega公司，型号： A5000) ; MTS 试剂盒 ( 美 国 Promega 公司，型号： 0000186480);山羊封闭血清(北京中杉金桥公司，型号 ZLI-9022)。
相关期刊推荐：《中国组织工程研究》杂于1997年创办，发表组织工程研究中关于干细胞培养与移植、组织构建、材料生物相容性评价(天然或合成材料与纳米粒子、人工材料植入体、植入器官及外源性细胞)、计算机辅助骨外科技术的应用基础及临床研究，转化医学和循证医学研究的文章，发表中国组织工程研究领域一流水平的学术、技术创新成果。
1.4 实验方法
1.4.1 神经干细胞的分离与培养 在无菌条件下，取出生 24 h内SD大鼠两侧海马，置于预冷的DMEM/F12培养基中;解剖显微镜下剥离血管和脑膜，将分离出的海马组织放入另一个预冷的DMEM/F12培养基中，缓慢轻柔吹打 15-20次后形成单细胞悬液;置于离心机中，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入无血清的神经干细胞培养基 (DMEM/F12培养基+2%B27+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)重悬;计数后以5×107 L -1接种于25 cm2培养瓶中，再置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。培养3 d半量补液，5-7 d后收集神经球，胰酶消化成单细胞计数后传代[16-17]。选取2，3代神经干细胞用于实验。
1.4.2 分组 实验分为2组：对照组和CINC-3组。对照组第3代神经干细胞用无血清神经干细胞培养基(DMEM/F12 培养基+2%B27)培养;CINC-3组第3代神经干细胞加入不同质量浓度 CINC-3 干 预 ， 培 养 条 件 为 DMEM/F12+ 2%B27+1，5，10，20 μg/L CINC-3。
1.4.3 MTS检测神经干细胞的存活率 将消化成单细胞的神经干细胞悬液接种至96孔培养板，每孔100 μL培养液，细胞密度为1×104 /孔，分为对照组和1，5，10，20 μg/L CINC-3组进行培养，每组5个复孔。培养5 d后，在每孔中加入20 μL CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent，避光，在37 ℃、体积分数为5%CO2环境下孵育2 h后终止培养。使用空白对照孔调零，在酶标仪上测定490 nm处吸光度值，结果以吸光度值进行换算得出存活率。MTS检测重复3次，取每组平均值进行统计学分析。
1.4.4 生长曲线观察神经干细胞的增殖情况 将对照组及CINC-3组(选用MTS检测结果中神经干细胞存活率最佳的CINC-3质量浓度)细胞机械吹打成单细胞悬液，以1× 108 L -1的细胞浓度接种至12孔板内，每组3个复孔，每天计数细胞个数，取其平均值，连续5 d，绘制生长曲线。
1.4.5 活/死细胞数染色观察神经干细胞的存活情况 将对照组及CINC-3组神经干细胞(选用MTS检测结果中神经干细胞存活率最佳的CINC-3质量浓度)用胰酶消化成单细胞悬液接种至12孔板内，加入0.4%锥虫蓝溶液均匀混合，对细胞进行染色，在3 min内光镜下取不重叠的3个视野，计数活细胞及死细胞数目，以平均值计算细胞活力，连续 5 d，观察细胞存活情况。
1.4.6 免疫荧光染色法观察神经干细胞的增殖情况 将对照组和CINC-3组(选用MTS检测结果中神经干细胞存活率最佳的CINC-3质量浓度)神经干细胞培养5 d后，接种于有预先包被0.01%多聚赖氨酸的玻片上培养，贴壁6-8 h后进行免疫荧光染色。各组细胞用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5 min;山羊血清室温封闭1 h，吸去血清，不洗;加入一抗(Nestin 1∶100)，4 ℃过夜;0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;加入荧光二抗的山羊抗鸡FITC(抗体工作浓度1∶100)，37 ℃避光孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;Hoechst染核5 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;荧光显微镜观察、照相。每组随机选取上、中、下、左、右5个非重叠视野进行细胞计数，计算出每个视野的Nestin阳性细胞球数。
1.4.7 Real-time PCR观察神经干细胞Nestin mRNA的表达 将对照组和CINC-3组(选用MTS检测结果中神经干细胞存活率最佳的CINC-3质量浓度)神经干细胞培养5 d后，取5×106个细胞，提取总RNA，操作严格按试剂盒说明进行;反转录成cDNA，反应体系为20 μL，包含4 μL 5×miScritHiSpec溶液，2 μL 10×miScritNucleics混合液， 2 μL miScript反转录混合液，2 μL无RNA酶水和10 μL模板 RNA。以β-actin为内参，利用ABI 7500 PCR仪进行 Real-time PCR扩增反应。反应条件：95 ℃变性15 min， 94 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，重复32 次循环。β-actin上游引物序列为：5'-CCG CGA GTA CAA CCT TCT TG -3'，下游引物序列为：5'-TGA CCC ATA CCC ACC ATC AC-3';Nestin上游引物序列为：5'-GGG GGT AGG AGA TGC CTT TG -3'，下游引物序列为：5'-CCT TTA GAG CAC CCA CCT CC-3'，实验结果重复3次，结果采用 2 -∆∆Ct法进行相对定量分析。
1.5 主要观察指标 ①原代培养的神经干细胞形态及神经干细胞标志物Nestin的表达;②MTS检测神经干细胞活力;③神经干细胞的生长曲线及存活情况;④免疫荧光法检测神经干细胞的Nestin蛋白表达;⑤Real-time PCR检测神经干细胞的Nestin mRNA表达。
1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件包处理数据，实验结果用x _ ±s表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)及SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 神经干细胞培养及鉴定结果 原代分离的神经干细胞在倒置显微镜下观察，细胞呈分散单个的圆球状，并悬浮于培养基中，细胞具有良好的折光性。培养第3天，形成 3-5个细胞的圆形或不规则形状小克隆神经球;培养第5-7 天，神经球由15-20个细胞聚集成克隆，神经球直径明显增大、较规则、饱满，具有较强的折光性。传代后，杂质细胞减少，神经球呈规则圆球形，折光性强，内部结构清晰，见图1。用神经干细胞标志物Nestin对神经球进行染色，结果显示神经球内大多数细胞呈Nestin染色阳性，见图2。
2.2 CINC-3对神经干细胞活力的影响 1 μg/L CINC-3组细胞活力与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，5， 10，20 μg/L CINC-3组细胞活力较对照组均增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中10 μg/L CINC-3组活力最佳， 20 μg/L CINC-3组与10 μg/L CINC-3组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。
2.3 CINC-3对神经干细胞生长曲线的影响 通过连续计数对照组和10 μg/L CINC-3组的细胞个数，绘制出生长曲线，见图4。从图中可见，对照组及10 μg/L CINC-3组神经干细胞的生长呈持续增殖趋势，培养前2 d细胞增殖速度较慢，培养3-5 d细胞增殖速度明显加快，培养5 d后10 μg/L CINC-3组的细胞数目明显高于对照组，增殖速率高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.4 锥虫蓝染色检测活/死细胞数 连续5 d经锥虫蓝染色后计数活/死细胞数目，发现神经干细胞死细胞数目极少，对照组第 1-5 天 的 存 活 率 分 别 为 (99.303±0.068)% ， (99.267±0.306)%，(99.232±0.101)%，(99.240±0.649)%， (99.279±0.100)%，CINC-3组第1-5天的存活率分别为 (99.187±0.085)%，(99.306±0.881)%，(99.203±0.465)%， (99.213±0.205)%，(99.253±0.300)%，细胞存活率均在 99%以上，且对照组及CINC-3组的细胞存活率差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.5 免疫荧光染色检测神经干细胞的Nestin蛋白表达 10 μg/L CINC-3组干预培养5 d，Nestin阳性神经球个数较对照组显著增多(P < 0.05)，见图5，6。
2.6 CINC-3对神经干细胞表达Nestin mRNA的影响 Real-time PCR检测结果显示，对照组和10 μg/L CINC-3 组干预培养5 d的Nestin mRNA表达量分别为1.007± 0.085，8.703±0.465，10 μg/L CINC-3组表达Nestin mRNA 水平明显上升，明显高于对照组(P < 0.05)。
3 讨论 Discussion
神经干细胞是一类具有自我更新、多向分化的一类未成熟前体细胞[18]。在胚胎发育过程中，神经干细胞存在于神经管内，随着生长发育的进行，其逐渐进入室管膜下区、纹状体和海马中并存留下来。成年哺乳动物的神经干细胞主要聚集于海马齿状回下层颗粒和侧脑室的室管膜下区[19]。在哺乳动物的生命周期进程中，神经发生持续存在，海马中的神经干细胞每天生成大量的神经元，迁移到发育中的神经系统，并不断整合到现有的神经网络中，成为成熟且具有功能的神经元，可以取代已经丢失的神经元，在学习和记忆贮存过程中发挥重要的作用[20-21]，故神经干细胞成为临床治疗神经系统疾病的种子细胞之一[22-23]。有研究表明，神经干细胞增殖能力下降会影响神经系统的修复和脑部功能的恢复，从而导致神经损伤和神经退行性疾病等[24]，同时会导致海马结构发育异常，海马是中枢神经系统管理学习能力和记忆功能的关键结构，其发育异常将导致学习和记忆功能障碍[25-26]。然而，成年哺乳动物体内神经干细胞数量较少，且多数处于静息状态。当机体发生损伤后，虽然能引起内源性神经干细胞增殖，但是再生能力极其有限，导致神经干细胞临床治疗存一定的局限性[27-28]。因此，探寻促进神经干细胞增殖的干预方法具有重要意义。该研究在体外原代分离新生SD大鼠海马来源神经干细胞，倒置显微镜下观察细胞呈分散单个的圆球状，并悬浮于培养基中，细胞折光性良好;继续培养3 d，形成3-5个细胞的圆形或不规则形状小克隆神经球;培养5-7 d，神经球由15-20个细胞聚集成克隆，神经球直径明显增大、较规则、饱满，具有较强折光性;传代至第3代，免疫荧光染色显示神经球内大多数细胞呈Nestin阳性，证明成功完成神经干细胞的体外原代分离、培养与鉴定，为后续实验的顺利开展奠定了基础。
脑内的神经干细胞受微环境中多重信号如生长因子、转录因子、细胞外基质蛋白以及临近各类细胞的影响，这些信号与神经干细胞发生直接或间接的作用，从而调控神经干细胞命运[29-32]。CINC-3是含ELR的CXC类趋化因子，在炎症反应中可诱导白细胞的趋化作用[33-34]，在中枢神经系统中，CINC-3与其受体CXCR2结合可能产生抗凋亡、促进少突胶质细胞增殖和抑制其迁移的功能，并于炎症过程中沟通着中枢神经系统和免疫系统，在二者之间起着桥梁的关键作用[35]。有研究证实，脑内CINC-3具有对抗神经退行性变和细胞死亡的新功能。当某一脑区受损，如缺血或脑外伤时，CINC-3会在损伤附近的脑脊液腔内积聚，这些炎症细胞可能从这里迁移到脑实质，是中性粒细胞跨越上皮屏障迁移的先决条件[36]。在创伤或阿尔茨海默病等引起神经元损伤或者死亡时，星形胶质细胞可上调CINC-3的分泌，这一功能的实现可能与蛋白酶活化受体的激活有关[36-37]，通过向皮质神经元发出信号，进一步激活星形胶质细胞，使其刺激CINC-3分泌，CINC-3通过与其受体CXCR2结合，产生了神经保护作用，保护神经元不受神经退行性变和细胞死亡的影响[38-39]。作者前期研究发现，骨髓基质细胞调控神经干细胞分化的条件培养液中有7种细胞因子的表达上调明显增加，其中CINC-3的表达上调了1.5倍[40]，由此推测CINC-3 可能具有促进神经干细胞增殖分化的作用。实验结果显示， 10 μg/L CINC-3对神经干细胞具有较好的促存活作用;生长曲线显示CINC-3组细胞数目明显高于对照组，增殖速度明显加快，提示10 μg/L CINC-3有促进神经干细胞增殖的作用;进一步免疫荧光染色、Real-time PCR显示，10 μg/L CINC-3促进神经干细胞表达Nestin，表明一定质量浓度的 CINC-3具有促进体外培养神经干细胞存活和增殖的作用。
综上所述，在一定质量浓度范围内CINC-3能正性调控新生大鼠海马来源的神经干细胞存活和增殖。在后续的研究工作中，将深入探讨CINC-3促进神经干细胞增殖的分子机制以及对神经干细胞分化的影响，将为治疗神经系统疾病及发育期神经发生障碍提供新的视角。
