摘要: 减数分裂重组不仅保证了真核生物有性生殖过程中染色体数量的稳定，还通过父母亲本间遗传物质的互换在后代中产生遗传变异。因此，减数分裂重组是遗传多样性形成的重要途径，也是生物多样性和物种进化的主要动力。在绝大多数真核生物中，不管染色体数目的多少或基因组的大小，减数分裂重组的形成都受到严格的调控，但抑制减数分裂重组的分子机理目前仍不清楚。近年来，通过正向遗传学筛选鉴定出多个减数分裂重组抑制基因，揭示了抑制基因的功能和调控途径。本文基于拟南芥中减数分裂重组抑制基因的研究现状，综述了植物减数分裂重组抑制基因研究取得的突破性进展，并结合基因功能与其调控网络阐述了抑制植物减数分裂重组的分子机理。
关键词: 减数分裂;同源重组;抑制基因;调控网络
减数分裂(meiosis)是生物细胞中染色体数目减半的一种特殊的细胞分裂方式，在该过程中 DNA 只复制一次，但细胞连续分裂两次，从而形成染色体数目减半的配子[1~3]。在减数第一次分裂过程中，为了确保同源染色体的精确分离和染色体数目的减半，同源染色体间需要形成至少一个物理连接点，称为交叉结(chiasmata)[4,5]。交叉通过修复作用产生同源染色体间遗传物质的相互交换，即同源染色体间的重组(recombination)，进而形成具有遗传多样性的配子[6,7]。减数分裂同源重组不仅保证了物种染色体的精确分离，同时又促进了父母亲本之间遗传物质的相互交换，从而在配子中形成遗传变异[8,9]。因此，减数分裂同源重组对生物进化和物种形成至关重要，也是植物新品种培育和开发的基础生物学过程。特别是在全球气候变化的背景下，人类面临各种挑战，减数分裂同源重组为充分利用植物的遗传多样性进行新品种的培育和创新提供了基础。
从植物进化的角度，重组率是生物在重组成本和重组优势之间维持的一种特定平衡，是物种长期以来对环境变化不断进化和演变的一种适应和自然选择[10]。在大多数真核生物中，由于调控重组基因的高度保守性，减数分裂重组率被维持在一个相对较低的水平，并且远低于其自身的自然潜力，但对其调控网络和抑制形成的分子机理还知之甚少[11,12]。减数分裂同源重组是真核生物有性生殖过程中的基本生物学过程，其相关研究一直是遗传学领域的核心科学问题，受到世界学者的广泛关注[13~16]。近年来，植物减数分裂同源重组的分子调控研究取得了重大进展，特别是多个减数分裂重组抑制基因陆续在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中被发现和鉴定，进一步增加了对这一复杂生物学过程的认识。本文以拟南芥为对象，综述了植物减数分裂重组抑制基因研究的重要进展。
1 DNA 双链断裂和交叉形成
1.1 DNA 双链断裂的产生
减数分裂同源重组起始于 DNA 双链断裂(double strand break, DSB)，其由高度保守的拓扑异构酶SPO11 (sporulation 11)蛋白催化形成(图 1)[6,17]。SPO11 蛋白结构类似于古细菌中的 TopoⅥ (Topoisomerase Ⅵ) A 亚基，而 TopoⅥ是由两个 A 亚基和两个 B 亚基组成的异源四聚体酶(A2B2 heterotetramer)[5]。最近，古细菌 TopoⅥ复合体 B 亚基的同源蛋白 MTOPVIB (meiotic topoisomerase VIB-like)在拟南芥和水稻 (Oryza sativa)中被鉴定，研究显示其在减数分裂中对诱导 DSB 形成和重组启动至关重要[18,19]。
拟南芥基因组存在 3 个 SPO11 同源基因 (SPO11-1、SPO11-2 和 SPO11-3)，但只有 SPO11-1 和 SPO11-2 作为异源二聚体参与调控减数分裂重组的启动，而 SPO11-3 只涉及体细胞的有丝分裂，不具有调控减数分裂的功能[20,21]。在植物中，其他一些基因也参与了诱导减数分裂 DSB的形成，如 PRD1 (putative recombination initiation defect 1)、PRD2、 AtPRD3/OsPAIR1 (homologous pairing aberration in rice meiosis 1)、DFO (DSB formation)和 CRC1 (central region component 1) [22~26]。不同于大部分植物中含有多个 SPO11 同源基因，在动物和酵母中只含有 1 个 SPO11 基因[27,28]。酵母中的 DSB 形成除了需要 SPO11 蛋白以外，还有其他 9 个蛋白参与调控，即 RED50 (radiation sensitive 50)、MER2 (meiotic recombination 2)、MEI4 (meiosis defective4)、MRE11 (meiotic recombination 11)、REC102 (recombination-deficient 102)、REC104 (recombination-deficient 104)、REC114 (recombination-deficient 114)、SKI8 (superkiller 8) 和 XRS2 (X-ray sensitive 2)[2,29]。然而，这些参与酵母 DSB 形成的蛋白在物种间存在蛋白序列或者功能上的变异。如拟南芥中 DSB 的形成并不需要 MRE11、 RAD50 和 XRS2 蛋白的参与，但这些蛋白直接作用于断裂双链 5′末端的切除;SKI8 尽管在几种真菌中非常保守，但在拟南芥中并不保守，且不参与减数分裂重组过程[30,31]。
1.2 重组中间体的形成与分解
DNA 双链断裂产生之后，MRN 复合体(MRE11、 RAD50 和 NBS1)对断裂双链任一侧的 5′末端进行切割，并产生3′端单链DNA(ssDNA)尾巴的突出端[32,33]。随后在 DMC1 (DNA meiotic recombinase 1)和 RAD51 (radiation sensitive 51)重组酶的促进作用下，这些 ssDNAs 启动同源序列搜索并入侵同源染色体或者非同源染色体的姐妹染色单体形成稳定的单链侵入中间体[34,35]。DMC1 是首次在酵母中发现的减数分裂特异基因，只在减数分裂过程中发挥作用，而 RAD51 参与了有丝分裂和减数分裂的重组。Kurzbauer 等[36]通过细胞学研究发现 DMC1 和 RAD51 重组酶倾向于定位于减数分裂 DSB 的相反两端，表明其在DSB 修复过程中承担着不同的生物学功能，这也与 DSB 两端不同的修复结果兼容。在单链入侵形成中间体后，3′末端入侵链作为引物纵向延伸到同源双链 DNA (dsDNA)中形成 D-loop (displacement loop)结构[37]。D-loop 的形成是减数分裂同源重组的重要中间体，其形成表明 3′端入侵单链成功定位到了同源 DNA 参考序列[38]，该早期中间体在之后可以通过不同的修复途径形成同源染色体交叉或者非交叉 (non-crossovers, NCOs)[39,40]。
D-loop 在酶催化作用下进一步被修复形成 Holliday junction (HJ)中间体结构，HJ 是由两个同源双链 DNA 分子互换配对并相互连接形成的一种“十字交叉”中间体(four-way junction)[41]。HJ 中间体的形成被认为是同源染色体交叉产生的关键结构，其两种类型的中间体(sHJ 和 dHJ)通过不同的修复途径产生两种类型的交叉[42,43]。在单链入侵形成 D-loop 结构后，如果 D-loop 的入侵链没有继续纵向延伸，则形成一个“十字交叉”中间体 sHJ (single Holliday junction)，进一步被 Mus81 (methyl methane sulfonate and ultraviolet sensitive 81)蛋白分解产生Ⅱ型交叉 (class Ⅱ CO)或者非交叉[39]。如果 D-loop 入侵链继续深入延伸到同源断裂双链中，并捕获断裂双链的第二端进行退火、合成与连接，则形成独特的异源双链 DNA 结构 dHJ (double Holliday junction)，并通过 ZMM (ZIP-MSH-MER)途径分解形成Ⅰ型交叉(class Ⅰ CO)[40]。
1.3 交叉的形成被严格限制
在减数分裂开始初期，DNA 双链产生大量双链断裂，但不管基因组的大小或者染色体数目的多少，只有极少数的断裂双链被修复形成交叉，其余的大量 DSBs 通过不同的途径和机制修复形成了非交叉。在模式植物拟南芥中，细胞学分析认为每个减数分裂的细胞大约形成 200 个双链断裂，但只有约 10 个断裂双链被修复形成交叉，其余的断裂双链则被修复产生非交叉，但到目前为止抑制交叉形成的机理尚不清楚[44~48]。
目前，多项研究表明交叉的形成主要受多个机制的共同影响，如交叉保障(obligate CO)、交叉干涉 (CO interference)、交叉稳态(CO homeostasis)和抗交叉因子(anti-CO factor)[49~59]。交叉保障是指每个配对同源染色体之间需要至少形成一个交叉以保障同源染色体后期的准确分离[49]。但是，在大部分生物中，一个交叉的形成会抑制其两侧相邻位置中另一个交叉的产生，最终导致交叉在染色体上非随机分布，这种现象被称为交叉干涉[50,51]。而交叉稳态则作为系统性缓冲机制，在早期交叉前体 DSB 数量急剧变化的情况下保持交叉数量的稳定[52,53]。近年来，减数分裂重组抑制基因在拟南芥中陆续被发现，揭示了重组中间体如何通过合成型依赖性退火反应 (synthesis-dependent strand annealing, SDSA)途径分解为非交叉的机制[54~59]。
1.4 交叉形成的遗传途径
在大多数真核生物的减数分裂重组中至少存在两种不同的交叉形成途径，根据对交叉干扰是否敏感将其分为Ⅰ型交叉和Ⅱ型交叉[60~62]。其中，Ⅰ型交叉为干涉敏感型交叉，约占交叉总数的 80%~ 85%，主要受保守的 ZMM 途径的调控，包括 MSH4 (mutS homolog 4)[63]、MSH5 (mutS homolog 5)[64]、MER3 (meiotic recombination 3)[65,66]、ZIP4 (zinc transporter 4 precursor)[67]、SHOC1 (shortage of crossovers 1)[68]、 HEI10 (human enhancer of cell invasion No.10)[69]、 RFC1 (replication factor C1)[70]、PTD (parting dancers)[1,71] 和 POL2A (DNA polymerase 2A)[72]等蛋白。而与Ⅰ型交叉对应的是干涉不敏感的Ⅱ型交叉，该交叉的形成依赖于两条平行的途径：MUS81 途径和 FANCD2 途径[73~75]。
通常情况下，两种交叉形成途径广泛存在于在大多数真核生物中，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，哺乳动物和植物[9,76]。但也有例外，如在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中，其减数分裂期间只形成 sHJ 中间体，故只存在Ⅱ型交叉形成途径[39]。而在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) 中，所有的交叉均表现为干扰敏感，表明其交叉的产生均通过Ⅰ型交叉形成途径[77]。此外，值得注意的是，在拟南芥 msh4 mus81 fancd2 三突变体中，虽然同时缺乏形成Ⅰ型和Ⅱ类型交叉的所有关键基因，但仍有交叉形成，这说明阻断Ⅰ型和Ⅱ型交叉形成途径后触发了其他未知的交叉形成途径产生交叉[74,75]。这种现象也被证实存在于果蝇和酵母中，这些证据表明其他交叉形成途径的存在，且与已知的交叉形成途径同时共存或是互斥独存[78,79]。
2 减数分裂重组抑制基因
在大多数真核生物的减数分裂过程中，双链断裂与交叉形成的比率(DSBs/COs)存在极大差异，如拟南芥中 DSBs/COs 比率约为 200∶10，这表明生物进化过程中存在着遗传机制限制大多数断裂双链修复形成交叉[80]。近年来，许多调控减数分裂过程的基因已经被克隆,但抑制减数分裂同源重组的分子机理仍不太清楚[20,25,81,82]。
多种模式植物(如拟南芥和水稻)基因组测序的完成和全基因组测序技术的成熟，加速了植物减数分裂重组抑制基因的鉴定与功能研究。2012 年，为了揭示减数分裂重组抑制基因，法国科学家 Crismani 等[54]利用正向遗传学通过 EMS 诱变拟南芥 zmm 突变体种子和大规模突变体筛选，并获得多个重组恢复系，最终鉴定出抑制Ⅱ型交叉形成的 9 个基因 (FANCM、MHF1/2、TOP3α、RECQ4A/B、FIGL1、 RMI1 和 FLIP，图 2)[54~57]。该研究巧妙利用了 zmm 突变体短角果的表型(因缺乏Ⅰ型交叉形成的 ZMM 基因而育性降低)进行果夹表型恢复系的筛选，其原理是重组抑制基因的突变会降低或者丧失重组抑制作用，这能促进交叉的形成和重组率的提高，进而恢复 zmm 突变体的育性，使植株的果夹变长甚至恢复原有长度。这样的重组恢复植株能非常容易的通过果夹长度表型筛选出来，最后通过全基因组测序鉴定突变基因。例如，拟南芥 FANCM 基因突变后，恢复了 zip4 突变体的育性，使 zip4 突变体的短果夹增长，进而筛选获得 fancm 突变体。
2.1 FANCM 联合 MHF1 与 MHF2 抑制减数分裂重组
FANCM (fanconi anemia complementation group M)解旋酶是在拟南芥中发现的首个减数分裂重组抑制蛋白，研究认为其通过 SDSA 途径分解 D-loops 中间体产生非交叉，从而抑制Ⅱ型交叉的形成[54,83,84]。拟南芥 fancm 突变体的交叉数量在雌雄两性的减数分裂过程中都得到极大提高，重组率也比野生型平均增加了 3 倍，但其植株的生长和生育情况与野生型无异，表明重组率的增加并不会影响植物的生长发育，证明植物在自然选择和进化过程中形成了遗传抑制机制限制过多的交叉形成[54]。由于Ⅰ型交叉特异性指示蛋白 MLH1 不能标记 fancm 突变体中增加的交叉，且花粉荧光标记四分体分析显示 fancm 突变体中不存在交叉干涉，证明 FANCM 不是通过Ⅰ型交叉形成途径抑制重组。而 fancm mus81 双突变体表现出严重的生长缺陷且缺乏二价体，表明 fancm 突变体中增加的交叉形成依赖 MUS81 蛋白。因此， FANCM 是通过Ⅱ型交叉形成途径抑制减数分裂重组。进一步研究发现，双突变体 fancm-1 spo11-1 和 fancm-1 dmc1 中的交叉未能恢复，表明 fancm 突变体中增加的交叉需要 SPO11 和 DMC1 蛋白的参与，即 FANCM 的抑制作用发生在 DNA 双链断裂和单链入侵之后[54]。在酵母中，FANCM 的同源基因 MPH1 和 FML1 分别在芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae) 和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中同样被证实通过分解 D-loops 中间体促进 SDSA 途径的非交叉形成[84,85]。
通过对所有 FA(fanconi anemia)途径相关蛋白的研究，发现只有 FANCM 的 DNA 结合辅助因子 MHF1 和 MHF2 具有抑制减数分裂重组的功能，其通过形成异源四聚体来增强 FANCM 解旋酶的活性，促进 FANCM 与 DNA 结合，从而抑制Ⅱ型交叉的形成[55,86~89]。在拟南芥多个突变体中，双突变体 msh5 mhf1、msh5 mhf2、hei10 mhf2 和三突变体 hei10 mhf1 mhf2 中二价体的形成没有差异，证明 MHF1 和 MHF2 通过相同的途径抑制减数分裂重组[55]。另一方面，mhf2 突变体仅能提高 1.6 倍重组率，但 fancm 和 fancm mhf2 突变体却能达 3 倍的增加，这表明 MHF2 与 FANCM 抑制重组的途径是一致的，但 MHF2 的抑制作用弱于 FANCM[55]。此外，在 mhf1 mus81 和 mhf2 mus81 双突变体中表现出严重的减数分裂缺陷，但单突变体 mhf1、mhf2 和 mus81 中未观察到明显的减数分裂缺陷，表明 MHF1 和 MHF2 对减数分裂重组的抑制作用依赖于 MUS81，这与 FANCM 的抑制途径相同[55]。因此，MHF1 和 MHF2 作为辅助因子参与 FANCM 的Ⅱ型交叉形成途径抑制减数分裂重组。
2.2 BTR 重组抑制途径
在减数分裂过程中，为了避免染色体间的纠缠和断裂，DNA 双链断裂及其修复过程中产生的重组中间体需要通过不同的途径分解成为交叉或者非交叉[90]。高度保守的 BTR 复合体(bloom syndromeTopoisomerase 3α-RecQ-mediated genome instability 1)在拟南芥(BLM-TOP3α-RMI1)和酵母(SGS1-TOP3α- RMI1)中通过限制减数分裂重组中间体形成交叉，进而保障了染色体的完整[91~94]。例如，BTR 复合体中的 RECQ4A/B、TOP3α 和 RMI1 蛋白通过同一途径抑制Ⅱ型交叉的形成，但与 FANCM 抑制途径不同[58]。 RECQ4A 和 RECQ4B 属于哺乳动物 BLM (酵母中为 SGS1)中的两个冗余同源蛋白，且 RECQ4B 只存在于十字花科植物中[95,96]，而 TOP3α 和 RMI1 为 BTR 复合体中的单拷贝基因[96]，其相互作用在减数分裂重组中发挥多种功能。
首先，RECQ4A/B、TOP3α 和 RMI1 蛋白均能通过 D-loop 重组中间体分解途径阻止Ⅱ型交叉的形成，促进非交叉的产生，但花粉荧光标记四分体对不同突变体重组率的检查显示不同基因及组合对重组提高的强度不同[58]。例如，单突变体 recq4a 和 recq4b 中的重组率没有显著增加，而双突变体 recq4a recq4b 中的重组率平均提高了 5 倍，突变体 recq4a recq4b fancm 的重组率甚至提高了 9 倍。这样的重组叠加效应也发生在 top3α和 top3α fancm、rmi1和 rmi1 fancm 突变体中，其重组率分别平均提高了 3 倍和 5 倍、4 倍和 5 倍，这表明 BTR重组抑制途径与 FANCM 途径相互独立但并非功能冗余，这可能与 BTR 复合体在减数分裂重组过程中发挥多种功能有关[56,58]。由于 RECQ4A/B、TOP3α 和 RMI1 两两组合的突变体中(recq4ab top3α、recq4ab rmi1 和 top3α rmi1) 均表现出严重的减数分裂缺陷，导致不能直接测量这些基因型组合的重组率，但推测其可能通过同一途径协同抑制交叉形成，因为：(1) RECQ4A/B、 TOP3α 和 RMI1 同属于 BTR 蛋白复合体，且均从拟南芥和其他物种的体细胞中共同纯化形成;(2) recq4ab 和 rmi1 突变体具有相似的重组增加情况;(3) 其与 fancm 形成的双突变体均表现重组叠加效应。
相关期刊推荐：《遗传》杂志是中国遗传学会和中国科学院遗传与发育生物学研究所主办、科学出版社出版的学术期刊，中国科技核心期刊。本刊的任务是报道国内外遗传学最新研究成果与进展，推动学科进步。读者对象为基础医学、农学、生命科学领域的科研、教学及开发人员，大学生、研究生、中学生物教师等。
