摘要：微生物是污水处理工艺中污染物的重要分解者，重金属对活性污泥微生物具有一定毒性。为了研究和比较重金属对活性污泥微生物的毒性影响，采用发光细菌毒性、活性污泥脱氢酶毒性、硝化抑制毒性3种方法测定4种重金属(Hg、Cd、Zn、Pb)对活性污泥微生物的毒性，并对测定结果进行了比较。结果表明，4种重金属均可降低污泥系统CODCr的去除率，其中，Cd和Hg对CODCr去除率的影响最明显(43.2%-92.3%和52.4%-92.5%)，而Pb和Zn对活性污泥CODCr去除率的影响较小。发光细菌毒性测定方法的灵敏度最高(达50%以上)，测得的重金属半数有效浓度(EC50)最低(Hg9.6mg·L−1，Cd0.3mg·L−1，Zn3.6mg·L−1，Pb13.9mg·L−1)，4种重金属对发光细菌发光强度的抑制程度表现为Hg>Cd>Zn>Pb，发光细菌的发光强度抑制率与重金属的对数浓度呈极显著的线性相关关系(P<0.01)，发光细菌发光强度随重金属对数浓度的增大而减小。活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性的测定结果与发光细菌毒性测定结果相比，灵敏度相对较低，测得的重金属EC50相对较高，活性污泥脱氢酶活性的抑制程度大小顺序为Cd>Hg>Zn>Pb，与测得的活性污泥硝化速率抑制程度大小顺序一致，但二者测得的EC50有所差别。4种重金属与活性污泥脱氢酶活性的Logistic回归方程均达到极显著水平(P<0.01)，活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而升高，当重金属浓度较低时，其对活性污泥SVI的影响并不大。为了更准确地判定重金属对活性污泥微生物的毒性影响，应取不同的重金属毒性终点指示指标进行毒性组实验，而不能以发光细菌毒性的单一测定结果作为评判依据。
关键词：重金属;发光细菌;脱氢酶;硝化抑制
随着工业化进程的加快，各大城市纷纷建立工业区集中水处理设施，减轻了城市污水处理系统及地表水的负担(王凯军等，2001;余杰等，2007;Vachovápetal.，2017)。然而，受到城市规划的历史影响，有时工业废水会流入城市生活污水处理系统中，容易对其中的微生物造成影响，并且降低活性污泥的处理效率。在城市废水的集中生化处理过程中，活性污泥法由于低价高效而被普遍使用。而活性污泥法中，微生物是有机污染物的主要分解者，当重金属存在时，会对活性污泥处理系统造成很大影响(赵庆良等，2006;竺建荣等，1999;Goronszyetal.，1996)。活性污泥法被广泛应用于城市污水和工业废水的集中生化处理中，其本质是污泥微生物通过氧化水中的有机物质，产生维持自身生存和增长的能量，同时达到降解有机物、净化水质的目的(竺建荣等，1999;Rodrãguezetal.，2018)，这也是防止工业污水进入城市污水处理系统的最主要手段之一。因此，活性污泥法被广泛应用于城市废水的集中生化处理过程中。在活性污泥生物处理过程中，微生物生命活动需要大量的营养物质，其中就包括作为酶的活性剂与活化剂的微量重金属(刘锐等，2001;李娟英等，2009;Jacobetal.，2018)。
微生物是污水处理工艺中污染物的重要分解者，重金属对活性污泥微生物的毒性研究也一直备受关注(李娟英等，2009;刘新春等，2005)，重金属对微生物的毒害作用可导致处理系统的微生物种群结构发生改变，影响污水处理效果。近年来不少学者开展了重金属毒性带来的污水处理影响机理，并提出了相应的检测方法，探究重金属对微生物结构和活动产生的作用(蒋成爱等，2001;吕锡武，2001)，但是所提出的观点不尽一致，研究视角也不尽相同。由于测定方法不统一，且每种方法都有其优缺点和适用条件，导致很多的研究结论差别很大，有的甚至相互矛盾(谢冰等，2003;Weietal.，2010;Miśkowiecetal.，2015;Yangetal.，2018)。从目前的研究成果来看，在重金属对生态环境的毒性影响方面最常用的毒性测定方法是生物试验法，即通过生物体或细胞的存活时间和繁殖量来判断毒性的大小，从而获得重金属毒性的相关信息。由于重金属对活性污泥微生物的毒性与化学反应速率和微生物生长速率有关，单一采用生化法或生物法测得的结果无法为活性污泥工艺运行提供科学指导。鉴于此，笔者以活性污泥为受试对象，研究了4种常见重金属对污泥活性及微生物的影响，尝试运用不同测定方法来研究重金属对活性污泥微生物的毒性，以期为污水生物处理工艺运行和设计管理提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
药剂：ZnCl2、PbCl2、CdCl2、HgCl2、CuSO4、Pb(NO3)2、Hg(NO3)2、氯化三苯基四氮唑(TTC)标准溶液，均为分析纯。
细菌：502发光细菌冻干粉，来源于福建省农科院。
活性污泥：活性污泥脱氢酶毒性实验和硝化抑制毒性实验中所用活性污泥分别取自城市污水处理厂A/O工艺的A段和O段(具有硝化功能的活性污泥)。该污水处理厂接纳的污水中，90%是生活污水，10%为工业污水，主要包括食品加工厂、物流冲洗污水和餐饮污水，挥发性悬浮固体(VSS)浓度与总固体悬浮物(SS)浓度之比约为0.71，污泥沉降指数(SVI)为78-109，pH为7.8。
模拟废水：采用葡萄糖、奶粉、磷酸二氢钾、氯化铵配制，4种物质的比例为20꞉5꞉5꞉1，CODCr为600mg·L−1左右，NH4+-N浓度为50mg·L−1，4℃保存。
重金属溶液：配制重金属浓度为1.0g·L−1的溶液，备用。
主要仪器：ET-99718微电脑化学需氧量测定仪;YSI-5000DO测定仪;岛津UV-2450紫外可见分光光度计。
1.2试验方法
1.2.1一次暴露
试验取离心(3000r·min−1，20℃)后的活性污泥30g加入1500mL曝气反应器中，然后分别加入含不同浓度重金属的模拟废水1000mL，充氧曝气24h，反应后采用MLSS型悬浮物(污泥)浓度计(德国，MLSS10AC+MLSS-S0C10)测定该活性污泥系统的污泥沉降指数(SV30)、活性污泥中悬浮固体含量(MLSS)，并计算污泥体积指数(SVI)：SVI=SV30/MLSS;使用显微镜观察污泥中的生物相;静置沉淀60min后取上清液测CODCr值;最后测定反应后活性污泥的脱氢酶活性、活性污泥的耗氧速率(活性污泥耗氧速率测定仪，美国，AER-208)，所有试验维持曝气量不变。
1.2.2中毒污泥二次培养试验
采用二次培养试验检验重金属中毒活性污泥经短时间培养后的活性恢复情况。从曝气反应器中取出活性污泥混合液，离心后弃上清液。并使用蒸馏水洗涤3次，加入不含重金属的模拟废水，曝气反应24h，然后测定废水CODCr值及活性污泥的耗氧速率。
CODCr采用快速COD测定仪检测;耗氧速率采用YSI5000DO测定仪测定;脱氢酶活性采用岛津UV-2450紫外可见分光光度计测定，其作用原理为：无色的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物在脱氢酶作用下可转化为红色的三苯甲基(TF)，因此，通过检测TF的产生量可间接评价污泥脱氢酶的活性。
1.2.3活性污泥脱氢酶毒性测定
(1)TTC标准曲线绘制(李光伟等，2007)
分别取TTC质量浓度为0、20、40、60、80、100、120、140μg·mL−1的标准溶液各1.0mL，置于10mL离心管中，再加入2mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液、1mL质量分数为10%的Na2S溶液和1mL蒸馏水;将离心管置于37℃恒温水浴中振荡30min，加入0.5mL甲醛，再加入5mL质量分数为80%的丙酮，在37℃恒温水浴振荡10min，萃取完毕后，于4000r·min−1离心5min，取上清液于分光光度计485nm处测定吸光度;以TTC质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算TTC还原产物三苯甲基(TF)的生成量。
(2)活性污泥脱氢酶毒性试验
将活性污泥先曝气24h，以保证所有外源基质被耗尽，然后取适量污泥混合液，用蒸馏水洗涤2次后加水稀释，将MLSS控制在2000mg·L−1左右，从中取一系列体积为50mL的污泥混合液样品，并测定样品的初始活性污泥脱氢酶活性;为消除pH对实验结果的影响，用磷酸盐缓冲溶液将样品的pH调节为7.2;根据样品的重金属浓度梯度，向样品中加入不同量的重金属化合物，并保持样品总体积不变;将样品振荡2h后，测定抑制后的活性污泥脱氢酶活性，同一污泥混合液样品平行测定3次。
相关期刊推荐：《生态环境学报》Ecology and Environmental Sciences(月刊)曾用刊名：土壤与环境;生态环境;热带亚热带土壤科学，1992年创刊，主要刊登国内外生态学和环境科学具有明显创新性和重要意义的原创性研究论文、重大调查研究报告，以及对这两个学科的重大前沿问题有独到见解和理论建树的综述文章和观点类文章。适合从事生态学、环境科学、资源保护、土壤学、大气科学、水科学、地理学、地质学、地球科学、农业科学、林学、医学、社会科学、经济科学等领域的科技人员、学者、教师、学生、各级管理者和环境爱好者阅读。
取1mL污泥混合液样品置于10mL离心管中，依次加入2mLTris-HCl缓冲溶液、0.5mL质量浓度为0.1mol·L−1的葡萄糖溶液和0.5mL质量分数为0.4%的TTC溶液;并迅速将制备好的样品放置于37℃恒温水浴中振荡2h，然后加入0.5mL甲醛终止反应;于4000r·min−1离心5min后去除上清液，加入5mL萃取剂，于37℃恒温水浴振荡10min;萃取完毕后再于4000r·min−1离心5min，取上清液于分光光度计485nm处测定吸光度;取经离心的沉淀污泥在105℃烘干2h测其质量。
2结果与分析
2.1重金属对污泥活性的影响
2.1.1重金属对活性污泥CODCr去除率的影响
由图1可知，在不同浓度条件下，4种重金属均可使污泥系统的CODCr去除率下降。其中，Cd和Hg对CODCr去除率的影响最明显(其变化幅度较大)，这2种金属浓度为50mg·L−1时，对系统的处理能力产生很大影响，CODCr去除率均降至50%以下;而Zn和Pb对活性污泥CODCr去除率的影响较小。
2.1.2重金属对活性污泥微生物脱氢酶活性的影响
重金属浓度与活性污泥脱氢酶活性的Logistic回归方程拟合参数如表1所示，由表可知，4种重金属与活性污泥脱氢酶活性的Logistic回归方程均达到极显著水平(P<0.01)，就k值而言，Cd和Pb实测值显著高于Hg和Zn(P<0.05);EC50大致表现为Pb>Zn>Cd>Hg，其中不同重金属EC50差异均显著(P<0.05);就b值而言，Hg显著高于其他重金属(P<0.05)，而其他3种重金属差异不显著(P>0.05)。
不同重金属对TF生成量的影响如图2所示，由图可知，不同重金属对TF生成量的影响较大，4种重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度均随着重金属浓度的增加而降低，表现为Cd>Hg>Zn>Pb。此抑制程度大小顺序与发光细菌的发光强度抑制率大小顺序有所不同，Cd对活性污泥脱氢酶活性的抑制作用大于Hg，Pb和Zn的EC50测定结果稍微偏大。
2.1.3重金属对系统SVI的影响
由图3可知，4种重金属对活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而升高，较低浓度重金属对活性污泥SVI值影响并不大，相同浓度下重金属对系统SVI的影响大致表现为Hg>Cd>Pb>Zn。
2.2重金属对污泥微生物毒性的影响
2.2.1重金属对发光细菌的毒性的影响
测定了Hg、Cd、Zn和Pb4种重金属对发光细菌的毒性，结果见图4，由图可知，发光细菌的发光强度抑制率与重金属的对数呈极显著的线性相关关系(P<0.01)，即发光细菌发光强度随重金属对数浓度的增大而呈下降趋势。因此，在给定重金属浓度的情况下，可以根据剂量-效应回归方程计算发光细菌的发光强度抑制率。
通过上述发光细菌的发光强度抑制率与重金属的对数浓度的线性相关分析，将重金属对数浓度(lgx)和发光细菌发光强度抑制率(i)进行回归分析，得到剂量-效应回归方程和重金属的EC50(见表2)。由表可知，4种重金属对发光细菌发光强度的抑制程度表现为Hg>Cd>Zn>Pb。
2.2.2重金属对硝化抑制的毒性
重金属浓度对活性污泥硝化速率的影响见图5，对实验结果进行Monod方程拟合，由图5可知，4种重金属对活性污泥硝化速率的抑制程度表现为Cd>Hg>Zn>Pb，与重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度大小顺序一致。
2.2.3重金属毒性测定结果的比较
利用不同重金属毒性测定方法得到的重金属毒性结果不尽相同。由图6可知，不同测定方法得到的每种重金属的EC50差异较大，有的甚至差1-5个数量级，这可能和不同测定方法本身的特点及测定条件有关。与发光细菌毒性测定相比，活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性测定的灵敏度有些偏低。就重金属Hg的EC50而言，发光细菌毒性、脱氢酶毒性和硝化抑制毒性基本表现为脱氢酶毒性>发光细菌毒性>硝化抑制毒性，其中脱氢酶毒性与发光细菌毒性差异不显著(P>0.05)，发光细菌毒性和硝化抑制毒性差异不显著(P>0.05);就重金属Cd的EC50而言，基本表现为硝化抑制毒性>脱氢酶毒性>发光细菌毒性，其中不同细菌毒性差异均不显著(P>0.05);就重金属Zn和Pb的EC50而言，基本表现为脱氢酶毒性>硝化抑制毒性>发光细菌毒性，其中不同细菌毒性差异均显著(P<0.05)。
3讨论
本研究中，在不同浓度条件下，4种重金属均可使污泥系统的CODCr去除率下降。其中，Cd和Hg对CODCr去除率的影响最明显(其变化幅度较大)，而Zn和Pb对活性污泥CODCr去除率的影响较小，这与Zn和Pb在水中的离子形态有关，Zn和Pb可与溶液中的OH−结合，形成各种不具备生物活性的配位化合物。不同重金属的外层电子排布不同，价态和离子半径也有所区别，这对TF生成量的影响较大，并导致其对活性污泥脱氢酶活性的抑制能力产生较大差异。此外，由图6可知，4种重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度均随着重金属浓度的增加而降低，Cd对活性污泥脱氢酶活性的抑制作用大于Hg，这可能与Hg在溶液中可以形成多种配位化合物，进而影响其生物毒性，而Cd在溶液中通常以Cd2+或稳定性较低的络合态存在，不会对其生物毒性产生较大的影响有关。Pb和Zn的EC50测定结果有些偏大，可能与这2种重金属在水中的存在状态有关，Pb和Zn可与溶液中的OH−结合，形成多种形式的配位化合物，另外由于金属离子浓度较高时，会导致其与活性污泥颗粒上的H+产生交换，造成溶液pH升高，OH浓度升高，从而导致游离态的重金属离子浓度降低。因此溶液中的Pb或Zn浓度表征的并不完全是具有生物活性的游离态离子浓度，故Pb和Zn的EC50测定结果偏大。
4种重金属对活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而升高，当重金属浓度较低时，对活性污泥SVI值影响并不大，其原因可能是：(1)重金属影响了活性污泥内微生物的细胞活性，降低了微生物自身的絮凝作用(镜检发现，重金属存在时，活性污泥中的菌群发生变化，可能由于耐毒性较强的丝状菌的存在使得活性污泥发生膨胀);(2)重金属大量存在时，重金属可置换出活性污泥中的H+，从而使环境pH值发生一定程度的下降，进而使活性污泥的沉降速度变慢(卢培利等，2008);因此在低浓度条件下，活性污泥SVI随重金属浓度增加变化不大，而高浓度条件下，活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而显著增加。4种重金属对活性污泥硝化速率的抑制程度表现为Cd>Hg>Zn>Pb，与重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度大小顺序一致，这可能和这2种测定方法的受试对象是活性污泥，重金属对活性污泥产生毒性的机理与发光细菌有所区别有关。活性污泥的硝化速率受重金属毒性的影响比活性污泥脱氢酶活性更为敏感，而且其影响可量化，便于测定，因此可以作为污水脱氮工艺受重金属毒性影响的指示指标。但因硝化细菌是一类比较敏感的菌群，受各种环境条件的影响较大，因此活性污泥的硝化速率是否可做为单一的重金属毒性的终点指示指标还有待进一步验证。
本研究中，不同测定方法得到的每种重金属的EC50差异较大，有的甚至差1-5个数量级，这可能和不同测定方法本身的特点及测定条件有关(图6)。与发光细菌毒性测定相比，活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性测定的灵敏度稍微偏低，这可能和污水处理工艺的实际运行条件有关，进入污水中的重金属经过各种转化，如沉淀，被有机质、矿物质吸附或被水中大量无机(Cl−、OH−、NH3)及有机配位体(如腐殖酸)络合而导致移动性降低，从而使重金属的存在形态和毒性发生变化，导致重金属毒性的测定结果产生偏差(陈同斌等，2003;谢冰，2002)。重金属使发光细菌的发光强度降低，是由于其影响了发光细菌发光酶的催化代谢途径;而重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制，是由于有机污染物中活化的H+通过活性污泥的电子传递体系传递给特定的受氢体的过程受到了影响;而硝化速率受到抑制主要是因为硝化限速步骤氨氧化过程中的氨单加氧酶(AMO)的活性受到了影响(谢冰，2002)。由此可知，重金属毒性测定方法、毒性评定对象的差异导致评定结果的差异，因此在实际运用中，应当根据具体的工艺原理和毒性评定对象特征，选择合适的重金属毒性测定方法。
由以上分析表明，多种重金属毒性终点指示指标均可以提示重金属对活性污泥微生物的毒性，例如，抑制BOD5或CODCr速率、活性污泥呼吸速率、活性污泥脱氢酶活性、活性污泥硝化速率及其细菌发光强度等，选择终点有效的指标对重金属对活性污泥微生物毒性进行评价，这逐渐成为众多研究学者的共识。为了正确判断重金属对活性污泥微生物毒性的影响，应该选择不同的毒性指标进行多组毒性测验，不能将发光细菌发光强度的抑制指标作为主要的判断标准，也不能仅仅追求速度，假如夸大重金属对污水的处理能力，这将造成处理污水成本大幅度上涨。
