摘要背景：超负荷量的运动会引起体内氧化活性物质大量堆积从而损害骨骼肌细胞，而线粒体在运动过程能量代谢中具有关键作用。研究表明，红景天可以减少肌组织脂质过氧化水平，保护受损内皮细胞。
目的：探讨红景天通过调节线粒体功能改善大强度运动小鼠骨骼肌细胞的功能。
方法：实验方案经西安石油大学伦理委员会批准。选择40只SPF级BALB/c小鼠，根据干预措施的不同，将小鼠分为空白对照组、单纯运动组、红景天对照组、红景天运动干预组。①空白对照组：不进行运动;②单纯运动组：采用生理盐水灌胃后，进行大强度运动;③红景天对照组：将红景天与生理盐水悬浊液灌胃，不运动;④红景天运动干预组：红景天干预措施同红景天对照组，运动方案同单纯运动组。以上各组干预措施均为每天1次，连续28d。观察小鼠的体质量、前肢握力、力竭时间;WesternBlot检测骨骼肌锰超氧化物歧化酶蛋白、p53蛋白、线粒体起源、自噬启动相关蛋白表达;RT-qPCR检测骨骼肌Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1mRNA表达。
结果与结论：①从第2周开始，单纯运动组小鼠前肢握力显著低于其他3组(P<0.05)，但空白对照组、红景天对照组与红景天运动干预组之间，小鼠前肢握力始终无明显差异(P>0.05);②第3，4周时，单纯运动组小鼠负重游泳训练力竭时间均显著短于红景天运动干预组(P<0.05);③单纯运动组小鼠骨骼肌细胞内的锰超氧化物歧化酶、p53蛋白表达显著高于其他组小鼠(P<0.05)，红景天运动干预组小鼠骨骼肌细胞内的锰超氧化物歧化酶、p53蛋白表达显著高于红景天对照组(P<0.05);④与空白对照组相比，单纯运动组小鼠骨骼肌内PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明显升高，Atg7、P62水平显著下降(均P<0.05)，与红景天对照组相比，红景天运动干预组PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明显升高，Atg7、P62水平显著下降(均P<0.05);⑤与空白对照组相比，单纯运动组的融合基因表达下降，分裂基因Drp-1mRNA表达上升(P<0.05);红景天运动干预组的融合基因表达也呈下降趋势，Drp-1mRNA表达水平呈上升趋势，但差异无显著性意义(P>0.05);⑥结果说明，红景天可显著提高大强度运动量小鼠的运动耐力，这可能与改善了骨骼肌线粒体自噬、起源及线粒体融合-分裂有关。
关键词：红景天;线粒体;运动;骨骼肌;锰超氧化物歧化酶;线粒体融合基因
引言Introduction
骨骼肌是人体运动的动力系统，其结构、功能与运动训练密切相关[1]。适宜的训练量可明显增强肌肉纤维的收缩力，使肌纤维增粗，优化肌肉群的运动能力。但在超负荷运动情况下，骨骼肌细胞会受到不同程度的伤害，严重时甚至会破坏原有正常结构，造成功能障碍[2-4]，这与体内氧化活性物质大量堆积有关。而线粒体在能量代谢过程中起着关键性的枢纽作用，其功能状态直接决定着肌肉功能[5-7]。红景天是一类生长于极地高寒地区的草本植物，生命力顽强，其根茎具有补气清肺、抗肿瘤、抗心血管疾病的作用[8-10]。近年来，红景天被逐渐应用于运动医学研究，但尚未见与大强度运动量后骨骼肌功能相关性的报道。因此，研究收集了40只BALB/c小鼠为研究对象，探讨红景天通过调节线粒体功能改善大强度运动量小鼠骨骼肌功能的机制，以期为临床实际应用提供理论基础。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计随机对照动物实验。
1.2时间及地点实验于2018年6至10月在西安交大医学院实验室完成。
1.3材料
1.3.1实验动物40只SPF级BALB/c小鼠(6-8周龄)购于南方医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2011-0015，单笼饲养，自然光照及饮水。
1.3.2实验用主要试剂红景天购于北京红景天技术开发有限公司。鼠抗一抗PGC-1α抗体、Atg7抗体、LC3抗体、P62抗体军购与美国CellSignaling公司。即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒购于金斯瑞生物科技有限公司。RNAisoPlusreagent试剂盒购于美国R&D公司。
1.4实验方法
1.4.1动物分组及运动强度计划适应性喂养1周后，根据干预措施的不同，将小鼠随机分为4组，每组10只。分别为：①空白对照组：采用生理盐水2mL灌胃，自然饲养，不进行任何运动;②单纯运动组：采用2mL生理盐水灌胃后30min，将小鼠置于跑台上进行大强度运动，时间约45min，坡度为0;第1周，起始速度设置为11m/min，每日递增1m/min;第2周开始，每周递增1m/min;③红景天对照组：按照小鼠体质量，以100mg/(kg·d)为标准，将红景天与生理盐水配置成2mL悬浊液，运动前30min灌胃，常规饲养，不运动;④红景天运动干预组：红景天干预措施同红景天对照组，运动方案同单纯运动组。以上各组干预措施均为连续28d。运动方案：小鼠运动强度第1，2，3，4周分别为11-17，18，19，20m/min，第1周，每天递增1m/min。天递增1m/min。
1.4.2前肢握力及力竭时间测试(1)前肢握力测试[11]：在每个干预周的最后1d，采用Model-RX-5系统对4组小鼠的前肢握力进行检测，检测至少在灌胃开始前2h进行，以系统显示的最大张力作为小鼠的最大前肢握力。(2)力竭时间测试[12]：采用负重游泳训练测试小鼠的力竭时间。将小鼠置于深约30cm的水槽中，保持水温25℃左右，在尾部负荷约小鼠10%自身体质量的金属条。从小鼠入水后开始计时，直至沉入水面下7s不浮出水面进行计算。力竭时间测试至少在灌胃开始前2h进行，且避开前肢握力测试当天。
1.4.3WesternBlot检测骨骼肌锰超氧化物歧化酶蛋白、p53蛋白、线粒体起源、自噬启动相关蛋白表达干预结束后处死小鼠，分离双侧腓肠肌，低温冻存。检测时，液氮研磨骨骼肌组织，裂解，提取总蛋白，BCA发测定蛋白浓度。电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育、ECL法显影定影。通过QuantityOne软件分析条带强度，以GAPDH为内参，检测锰超氧化物歧化酶、p53蛋白、线粒体起源、自噬启动相关蛋白(PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62)表达。
1.4.4RT-qPCR检测骨骼肌Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1mRNA表达水平采用TRlzol法提取骨骼肌组织中的RNA，采用β-actin作为内参基因，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，利用SYBGGreen试剂盒进行RT-PCR反应。设计Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1引物序列(表1)，反应条件为，50℃2min，95℃变性15s、30℃延伸30s，40个循环。基因相对表达水平采用2-??Ct法确定。
1.5主要观察指标①观察小鼠的体质量、前肢握力、力竭时间;②骨骼肌细胞内锰超氧化物歧化酶、p53水平、骨骼肌内线粒体起源、自噬启动相关指标蛋白(PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62)、线粒体融合与分裂基因(Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1)mRNA变化。
1.6统计学分析数据分析采用SPSS20.0软件进行。计量资料采用x_±s表示，组间比较的统计分析采用重复因素方差分析检验，组间两两比较，方差齐则采用LSD法，方差不齐采用Dunnett法。P<0.05认为差异有显著性意义。
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2结果Results
2.1实验动物数量分析实验选用小鼠40只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2各组小鼠体质量变化在初始测量及干预的第1-3周，4组小鼠的体质量差异均无显著性意义(P>0.05)，在第4周时，红景天对照组小鼠体质量显著高于单纯运动组(P<0.05)。
2.3各组小鼠前肢握力比较4组小鼠在初始测量及干预第1周时的前肢握力差异无显著性意义(P>0.05)。从第2周开始，单纯运动组小鼠前肢握力显著低于其他3组(P<0.05)，但空白对照组、红景天对照组与红景天运动干预组之间，小鼠前肢握力始终差异无显著性意义(P>0.05)。
2.4单纯运动组与红景天运动干预组小鼠的力竭时间比较在第1，2周，单纯运动组与红景天运动干预组小鼠的力竭时间比较差异无显著性意义(P>0.05)。第3周时，单纯运动组与红景天运动干预组的力竭时间分别为(583.61±47.28)s、(626.89±41.68)s，第4周时分别为(587.24±46.62)s、(638.78±38.15)s，差异均具有显著性意义(P<0.05)。
2.5骨骼肌细胞内锰超氧化物歧化酶、p53水平比较Western-blot检测结果显示，单纯运动组小鼠骨骼肌细胞内的锰超氧化物歧化酶、p53水平显著高于其他组小鼠(P<0.05)。与红景天对照组比较，红景天运动干预组小鼠骨骼肌细胞内的锰超氧化物歧化酶、p53水平也显著较高(P<
2.6红景天对骨骼肌内线粒体起源、自噬启动相关指标影响与空白对照组相比，红景天对照组小鼠骨骼肌内PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62水平均无明显差异;单纯运动组小鼠骨骼肌内PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明显升高，Atg7、P62水平显著下降(P<0.05)。与红景天对照组相比，红景天运动干预组4项指标水平差异均有显著性意义(P<0.05)。
2.7红景天对骨骼肌内线粒体融合-分裂相关指标的影响与空白对照组相比，单纯运动组小鼠的线粒体融合基因(Mfn-1、Mfn-2、Opa-1)mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)、分裂基因Drp-1mRNA表达水平明显上升(P<0.05)，红景天运动干预组的融合基因mRNA表达也呈下降趋势，Drp-1mRNA表达水平呈上升趋势，但差异无显著性意义(P>0.05)。
3讨论Discussion
骨骼肌是影响机体耐力的关键组织，适当的有氧运动可刺激肌纤维强壮增粗。而短时间的大强度运动会通过氧化应激、脂质过氧化等机制，破坏体内氧化/抗氧化系统的平衡，造成各种氧化过程的产物或衍生物大量堆积，抑制骨骼肌线粒体功能，使运动耐力下降[13-16]。
在此次研究中，从第2周开始，单纯运动组小鼠前肢握力显著低于其他3组，但空白对照组、红景天对照组与红景天运动干预组之间，小鼠前肢握力始终无明显差异;同时，在第3周及第4周时，单纯运动组的力竭时间明显短与红景天运动干预组。这表明，不恰当的运动量会对肌肉的力量及持久力造成损害，而红景天则对这种伤害表现出了一定的保护作用。这与Zhu等[17]研究的结论一致，研究者检测了血清超氧化物歧化酶及丙二醛水平，结果发现，大运动量小鼠的超氧化物歧化酶及丙二醛水平显著升高，而通过红景天干预，可有效减少相关酸性产物水平，表明红景天可减少肌组织脂质过氧化水平。降低活性氧水平、改善超氧化物歧化酶活性是红景天保护受损内皮细胞的重要机制。大强度运动会造成极易氧自由基大量堆积，诱导脂质发生过氧化，造成骨骼肌纤维损伤。而在补充红景天之后，实验小鼠的抗氧化能力明显加强，氧化损伤程度变小，线粒体相关的运动性疲劳也得到有效缓解。
锰超氧化物歧化酶是超氧化物歧化酶分子内所含金属离子Mn2+，主要存在于机体的线粒体中，主要发挥着祛除过剩的超氧自由基及抑制癌基因的作用[18-20]。p53是一个重要的抗癌基因，同时还具有协助细胞基因修复缺陷的功能[21-24]。Western-blot检测发现，单纯运动组小鼠骨骼肌细胞内的锰超氧化物歧化酶、p53水平显著高于其他组小鼠(P<0.05)。与红景天对照组比较，红景天运动干预组小鼠骨骼肌细胞内的锰超氧化物歧化酶、p53水平也显著较高。这表明，大运动量小鼠体内存在着明显的氧化应激反应。进一步检测发现，与空白对照组相比，单纯运动组小鼠骨骼肌内PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明显升高，Atg7、P62水平显著下降，与红景天对照组相比，红景天运动干预组4项指标水平均存在显著差异。这表明，短期内大运动量会抑制小鼠体内线粒体起源，同时诱发线粒体发生自噬。线粒体发生于线粒体自噬是控制线粒体质量的主要环节[25-27]。不同于一般体细胞，骨骼肌中的线粒体可通过自噬过程完成损伤线粒体的清除与更新，从而维持呼吸链的稳定平衡。一旦发生伤害性骨骼肌运动，线粒体可启动自噬过程清除异常线粒体，防止堆积，但同时也会造成肌肉功能不同程度的损伤。
防止堆积，但同时也会造成肌肉功能不同程度的损伤。“融合-分裂”是线粒体维持动态平衡的另一项重要机制，其中涉及的分子众多，形成复杂的调控网络[28-30]。当不良刺激超出线粒体代偿能力时，融合基因表达量会出现显著下降，在此次研究中，与空白对照组相比，单纯运动组小鼠的线粒体融合基因mRNA表达水平均明显下降、分裂基因Drp-1mRNA表达水平明显上升，红景天运动干预组的融合基因mRNA表达也呈下降趋势，Drp-1mRNA表达水平呈上升趋势，但差异无统计学意义。这表明，短期内大运动量会导致骨骼肌线粒体“融合-分裂”过程失衡，并影响线粒体功能。而红景天可通过调节线粒体“融合-分裂”过程，调节线粒体功能，减轻运动损伤。
综上所述，研究发现，红景天可显著提高大强度运动量小鼠的运动耐力，这可能与改善了骨骼肌线粒体自噬、起源及线粒体融合-分裂有关。
