摘要背景：生活于高原鼠兔的血液系统中外周血红细胞及骨髓有核红细胞数目及形态的变化，对其低氧适应有重要意义。
目的：通过对比高原鼠兔与大鼠在低氧前后外周血及骨髓红系细胞的变化，初步探讨高原鼠兔红系造血系统低氧适应的形态学变化。
方法：健康野生高原鼠兔及清洁级 SD 大鼠各 12 只，分别随机分为实验组和对照组，每组 6 只，实验组动物饲养在模拟海拔 5 000 m 高原低压低氧舱内，连续低压低氧干预 28 d，对照组动物在海拔 2 260 m 的实验室内饲养。
结果与结论：①对照组高原鼠兔较对照组大鼠红细胞直径小而计数多，低氧暴露 28 d 后，两组实验动物红细胞数、血红蛋白浓度及红细胞压积均升高(P < 0.05)，但高原鼠兔增高幅度明显低于大鼠，且高原鼠兔平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞血红蛋白浓度无明显变化;②骨髓涂片结果显示，低氧暴露后高原鼠兔中、晚幼红细胞比例无明显变化，但大鼠中、晚幼红细胞比例显著增加(P < 0.05);③胸骨苏木精-伊红染色结果显示，低氧暴露后高原鼠兔幼红细胞岛无明显变化，但大鼠幼红细胞岛明显增生;④结果显示，高原鼠兔在低氧暴露前后外周血及骨髓红系变化幅度明显低于 SD 大鼠，考虑高原鼠兔长期生活在高原低氧环境下，可能与其低氧适应机制有关。
关键词：高原鼠兔;大鼠;造血系统;骨髓;有核红细胞;幼红细胞岛;外周血;红细胞;低氧暴露;低氧适应中图分类号：R599，R331;R364
0 引言 Introduction
高原鼠兔属鼠兔科，形小如鼠，广泛分布于海拔3 000- 5 000 m的高寒草甸及草原地区，高原鼠兔在高原低压低氧环境下已经生活了3 700万年以上，是青藏高原上经过无数代的自然选择后而被保留下来的本土野生动物。通过国内外学者对高原鼠兔的生物习性、生理及遗传等方面的大量研究，目前认为该动物是研究低氧适应的最佳动物模型[1-2]。既往研究显示高原鼠兔在血液学上是以红细胞数量多、低血红蛋白水平、低红细胞压积为主要特征的，其血红蛋白和红细胞压积均明显低于生活在同一环境中的大鼠[3]，红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积不因海拔高度的增加而发生明显的改变，大鼠从海拔2 300 m到5 000 m，红细胞压积增加了57.3%，而高原鼠兔仅增加了15.8%[4]，高原鼠兔的这种血液学变化使得血红蛋白携带更多的氧到组织中，又不会使血液黏滞度过高从而影响组织灌流。
骨髓是重要的造血器官，其功能是产生造血干细胞，目前对高原鼠兔骨髓造血系统的研究尚属于空白，实验利用模拟高原低压低氧舱，观察高原鼠兔及大鼠在海拔 2 260 m及模拟海拔5 000 m低压低氧情况下外周血及骨髓造血系统的变化，初次描述了不同海拔高原鼠兔与大鼠骨髓造血系统红系形态学特征，为研究高原鼠兔低氧适应机制补充造血系统相关内容。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2018年11月至2019年5月在青海大学高原医学中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验仪器及试剂
低压低氧舱(贵州风雷机械公司)、全血细胞分析仪(西门子公司，德国)、光学显微镜 (Olympus公司，日本)、戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)、瑞氏-姬姆萨染液(索莱宝公司，北京)、苏木精-伊红染色试剂盒(索莱宝公司，北京)、40 g/L多聚甲醛固定液(索莱宝公司，北京)。
1.3.2 实验动物
高原鼠兔为12只健康野生雄性高原鼠兔，体质量110-150 g，捕捉自中国科学院海北高寒草甸生态系统定位站(37°40′N，101°23′E，海拔3 200 m，气压为 6 717 kPa)，捕获后饲养1周运回西宁地区。另取12只健康的清洁级SD大鼠，均为雄性，购于北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号：SYXK(京)2017-0022，实验动物均在西宁地区(海拔2 260 m)饲养4周后用于实验。
1.4 实验方法
1.4.1 分组及造模 高原鼠兔和SD大鼠分别随机分为实验组和对照组，每组6只。实验组动物饲养在模拟海拔5 000 m 高原低压低氧舱内，每日23 h(另有1 h开仓喂食水、换垫料等)，连续低压低氧28 d;对照组动物在海拔2 260 m的实验室内饲养。所有动物实验均获青海大学附属医院伦理委员会批准。
1.4.2 样品采集
外周血常规检查及血涂片观察：实验动物模拟低氧时间结束后，立即从低压低氧舱内取出，用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉。腹部皮肤消毒，切开皮肤分离组织，暴露出腹主动脉，用肝素化注射器经腹主动脉采血1 mL于 EDTA抗凝管中。同时每只动物制作血涂片4张，经瑞氏- 姬姆萨染色后在显微镜下观察。
骨髓涂片观察：实验动物处死后分离双后肢股骨和胫骨，剪开长骨两端，用断端直接在载玻片上行骨髓推片，每只小鼠同时制作骨髓涂片6张，经瑞氏-姬姆萨染色后在显微镜下观察。
胸骨组织切片观察：实验动物处死后分离胸骨，40 g/L 多聚甲醛固定2 d，冲洗后放入体积分数10%脱钙液1周，每隔2 d换液1次，常规脱水、浸蜡、包埋后进行5 μm连续切片，行苏木精-伊红染色后在显微镜下观察。 1.4.3 指 标测 定 采用 全自 动 血细 胞 分析 仪 ( 美 国 Bio-Rad公司)测定红细胞数、血红蛋白浓度、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞血红蛋白浓度等红细胞指标。
外周血涂片：由2名高年资形态学医师观察，选取头体尾分明，厚薄适宜，制片及染色均良好的涂片观察红细胞形态，随机选取红细胞，采用Mshot软件测量红细胞直径。
骨髓涂片：在低倍镜下观察骨髓增生程度，油镜下观察骨髓各系细胞形态，分类计数200个有核细胞并计算出红系各阶段的百分率，分别由2名高年资形态学医师观察后取平均值。
胸骨组织切片：应用苏木精-伊红染色法，其中苏木精能将细胞核内的染色质染成紫蓝色，而伊红能将细胞质及细胞外基质染成红色，染色后能够区分出细胞的形态。 1.5 主要观察指标 低氧暴露28 d前后实验动物血常规各项指标测定、外周血细胞、骨髓红系造血细胞及胸骨组织苏木精-伊红染色形态。
1.6 统计学分析 通过SPSS 17.0软件进行数据统计分析，数值均为正态分布，计量资料以x _ ±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用独立样本t 检验，统计学显著性水平为P < 0.05。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 纳入高原鼠兔和SD大鼠12只，均进入结果分析，无死亡和感染，无脱失值。
2.2 低氧暴露28 d前后实验动物外周血测定结果外周血涂片观察结果：
各组取材、涂片、染色良好，每组实验动物红细胞形态正常。对照组高原鼠兔的红细胞直径为(6.70±0.65) μm，大鼠红细胞直径为(8.20±0.68) μm，高原鼠兔的红细胞体积小于大鼠，低氧28 d后两组实验动物外周血涂片红细胞体积及形态等在显微镜下观察未见明显变化，
血常规各项指标测定结果：低氧28 d后，高原鼠兔红细胞数、血红蛋白浓度及红细胞压积等指标较对照组升高 (P < 0.05)，但平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞血红蛋白浓度两者间均无显著性差异(P > 0.05);低氧28 d后大鼠红细胞相关指标较对照组均有不同程度升高，且升高幅度明显高于高原鼠兔，
2.3 低氧暴露28 d前后实验动物骨髓造血系统变化情况各组取材、涂片、染色良好，红系增生，各阶段细胞形态大致正常，见图2。高原鼠兔低氧28 d组中幼[(12.33±1.37)%]，晚幼[(18.66±2.54)%]红细胞占有核细胞比例较对照组中幼[(12.16±3.75)%]、晚幼[(17.33±3.17)%]红细胞比例无显著差异 (P > 0.05) ;大鼠低氧 28 d 组 中 幼 [(20.17±1.57)%]、晚幼[(19.00±2.79)%]红细胞占有核细胞比例明显增高，与对照组大鼠中幼[(7.00±1.79)%]、晚幼 [(11.17±0.52)%]红细胞对比有显著性差异(P < 0.05)，两组实验动物低氧28 d前后原始红细胞及早幼红细胞比例两者之间均无显著性差异(P > 0.05)，见图3。粒系增生，各阶段细胞形态大致正常。
2.4 胸骨组织苏木精-伊红染色形态 高原鼠兔对照组及低氧28 d组骨髓增生均活跃(约90%)，两组红系各阶段可见，均以中晚幼红细胞增生为主;粒系各阶段可见，均以中幼及以下阶段细胞增生为主，嗜酸性粒细胞较易见，形态未见明显异常;巨核细胞数量大致正常，以分叶核增生为主。大鼠对照组及低氧28 d组骨髓增生均活跃(约90%)，红系各阶段可见，以中晚幼红细胞增生为主，大鼠低氧28 d 组较对照组可见较多幼红细胞灶性分布(幼红细胞岛);大鼠对照组巨核细胞数量大致正常，以分叶核增生为主，而低氧28 d组巨核细胞数量明显增多，散在及小簇状分布。
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3 讨论 Discussion
实验研究结果表明，低氧暴露28 d后高原鼠兔及大鼠红细胞相关指标变化各有不同。在海拔2 260 m高原鼠兔相比于同海拔大鼠红细胞数目多、体积小，但红细胞压积和血红蛋白含量两者相近，这些结果与先前的报道一致[5]。低氧28 d后高原鼠兔和大鼠的红细胞数、血红蛋白和红细胞压积均有所增高，但高原鼠兔血红蛋白增高幅度明显低于大鼠，且高原鼠兔红细胞体积无明显变化，这与以往认为高原鼠兔低氧暴露后平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞血红蛋白浓度均低于常氧的结论不一致[6]。实验动物对低氧的血液学代偿反应主要表现为红细胞数增多、血红蛋白含量升高及红细胞压积增加，这是机体在低氧环境中提高携氧能力的适应对策，这种变化增加了红细胞的表面积，有利于氧的弥散，能够使血红蛋白携带更多的氧到组织中[7-8]。实验中，低氧暴露28 d后高原鼠兔红细胞体积相关指标无明显变化，而大鼠明显增高，表明大鼠为了适应高原低氧环境增加红细胞数量与体积从而增加携氧量。高原鼠兔红细胞体积小，当海拔升高时，红细胞数量代偿性增多，但体积无明显变化，有助于减少血液循环阻力，这比大鼠低氧应激后同时增加红细胞数目与体积，从而增加血液循环阻力产生不良影响有利，这是高原鼠兔在血液方面适应高原的主要特征，此结果与高原世居人群和其他动物是一致的[9-11]。高原鼠兔对低氧的适应机制与大鼠虽有相同之处，但明显优于大鼠，这也无疑是高原鼠兔适应高原低氧环境的有利机制。
高原土著动物经过长期的进化和自然选择后具有适应低氧的能力，在血液学上表现为血红蛋白结合、释放氧的能力明显高于平原动物，这对低氧时体内氧的传递是有利的[12-13]。与平原动物相比，高原土著动物氧解离曲线左移，血红蛋白对氧的亲和力增加，使得PO2和SO2水平增高，另外，其氧解离曲线的中段较陡，有利于氧在肺部的运输与释放，便于组织脏器获取更多的氧[14-15]。
骨髓是重要的造血器官，其功能是产生造血干细胞，这些造血干细胞增殖、分化、成熟形成各种血细胞如红细胞、白细胞及血小板[16]。已知文献中尚未发现对高原鼠兔骨髓造血细胞变化的相关研究。实验首次观察了低氧28 d 前后高原鼠兔和大鼠骨髓涂片及胸骨组织切片中有核红细胞变化，结果表明，对照组高原鼠兔骨髓中有核红细胞比例及幼红细胞岛较对照组大鼠增多，低氧暴露28后高原鼠兔骨髓中有核红细胞比例及幼红细胞岛无明显变化，但大鼠在低氧暴露后骨髓中上述指标较对照组明显增多。骨髓中的红系造血活动活跃，导致外周血红细胞增多。既往对比高原移居与世居者的骨髓象，结果显示移居者的骨髓红系增生明显，以晚幼红细胞增生为主，而世居者的骨髓象则与平原健康人骨髓象相似[17]。
高原低氧适应动物骨髓组织中有核红细胞增加的现象可能与体内促红细胞生成素等调节激素的作用有关[18]，当机体低氧时，体内促红细胞生成素增多[19-20]，刺激骨髓原始红细胞增多，加速其分化为有核红细胞，促进红细胞成熟，进而使得外周血中的红细胞增多[21]。另外，骨髓红系增生活跃，致外周血红细胞过量，同时巨噬细胞因缺氧、胞质水肿，吞噬红细胞功能减弱，从而导致骨髓中有核红细胞及外周血中红细胞破坏减少，使其数目增多[22-23]。
在低氧应激下，缺氧诱导因子1α能够转录调控促红细胞生成素、血管内皮生长因子等靶基因的表达，刺激红细胞生成与成熟，增强血管再生[24]。XIE等[1，25]报道，当鼠兔暴露于低氧环境时骨骼肌中缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子对低氧应激的反应减弱。实验中，在海拔2 260 m 时高原鼠兔骨髓有核红细胞数目较同海拔地区大鼠偏高，但当加重低氧程度后其骨髓有核红细胞无明显变化，可能与高原鼠兔骨髓组织对低氧反应的钝化有关，是否与骨髓组织中低氧相关基因的表达有关有待进一步验证。
实验比较了高原鼠兔和大鼠暴露于模拟海拔5 000 m的低压低氧环境28 d前后的血液系统变化，结果表明对照组中高原鼠兔较大鼠红细胞数量多而体积小，低氧暴露28 d后，高原鼠兔和大鼠的红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积均升高，但高原鼠兔的升高水平明显低于大鼠，且红细胞体积无明显变化，这与以往的研究结果不甚一致，提出了新的结论。同时实验首次对高原鼠兔和大鼠在低氧环境下骨髓造血系统有核红细胞的形态学变化做了详细的对比，结果表明低氧暴露28 d后高原鼠兔骨髓红系无明显变化，但大鼠骨髓红系明显增生。这些发现为将来深入研究高原土著动物以及高原适应人群造血系统的低氧适应机制奠定了基础。
