摘要背景：人类白细胞抗原 HLA 经过长期进化形成丰富的多态性，近几年由于受检人数增加及 HLA 分型技术快速发展，HLA 新基因不断被发现。
目的：采用下一代测序技术对 1 例白血病患者及家系 HLA-B 基因的全长序列及 18 个点突变进行分析。方法：应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)及聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)发现患者的 HLA-B 结果异常。为了鉴定该基因，采用下一代测序技术对该基因全长进行测序，同时采集患者父亲、母亲及 2 位同胞姐妹的血样进行 HLA 基因的遗传学分析。结果与结论：应用序列特异性寡核苷酸探针杂交及聚合酶链反应-直接测序法均提示该样本 HLA-B 无完全匹配的基因型。应用下一代测序技术分析发现，与同源性最高的等位基因 B*15:09:01 相比，该基因在外显子、内含子和 3′UTR 共存在 18 个碱基突变。5 个外显子碱基突变位于第 3，4 外显子，分别为：第 486 位 G→C、第 583 位 T→C、第 636 位 T→C、第 652 位 A→G 和第 756 位 C→T，导致 5 个相应密码子发生改变，其中 2 个碱基替换为错义突变，第 171 位酪氨酸(Tyr)→组氨酸(His)、第 194 位异亮氨酸(Ile)→缬氨酸(Val)。家系调查显示患者 HLA-B 新基因来源于父亲。新基因序列已递交给 Genbank 数据库(MG595995)。应用下一代测序技术鉴定了 1 个 HLA-B 新等位基因，该基因于 2017 年 12 月被 WHO HLA 因子命名委员会正式命名为 HLA-B*15:435。
关键词：白血病;人类白细胞抗原;新等位基因;下一代测序技术;家系调查;碱基突变;序列特异性寡核苷酸探针杂交;聚合酶链反应-直接测序法
0 引言
Introduction 人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是位于6号染色体短臂上紧密相连的基因簇，与机体的自我识别和免疫应答密切相关，在长期的进化过程中形成了高度多态性和不同种族、不同地域独特的分布特征[1-2]。自1958 年第1个HLA抗原被发现以来，越来越多的研究表明其在移植排斥反应、疾病相关性研究和法医学等多个领域均有紧密关联[3-5]。精准的HLA分型结果为器官移植、造血干细胞移植、疾病相关性研究、亲子鉴定、群体遗传学等提供了基础数据[6-7]。截止到2018年10月为止，已发现的HLA等位基因有 20 088 个，其中 HLA-B 有 5 590 个等位基因 (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats)。作者所在实验室应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(polymerase chain reaction and sequence-specific oligonucleotide probes， PCR-SSOP)和聚合酶链反应-直接测序法(polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT)对临床样本HLA分型时发现结果异常，对疑似为新基因的样本采用基于 ION S5TM 测 序 系 统 的 下 一 代 测 序 技 术 (next generation sequencing，NGS)进行鉴别，鉴定了一个 HLA-B新等位基因。新的基因序列已提交至Genbank (MG595995)。该基因于2017年12月被世界卫生组织HLA 因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435，现将该基因的检测、鉴定、全长序列分析及家系调查报道如下。
1 对象和方法 Subjects and methods
1.1 设计 应用PCR-SSOP、PCR-SBT和NGS联合检测样本，并进行家系调查。
1.2 时间及地点 于2017年6月在深圳市血液中心输血医学研究所完成HLA分型检测。
1.3 对象 1名患有急性髓细胞白血病的女性患者，籍贯广东，汉族。2017年6月到作者所在实验室做造血干细胞移植前配型时发现HLA-B分型结果异常。在征得知情同意后，采集其一级家属包括父亲、母亲、同胞姐妹的EDTA 抗凝全血做家系调查分析。
1.4 方法
1.4.1 实 验 试 剂 和 仪 器 核酸提取试剂 ( 批 号 ： S4101-18005)(中国台湾芮宝公司);LABTypeTM SSO 流式磁珠分型试剂(批号：LOT 005)(美国One Lambda公司); SeCoreTM测序试剂盒(批号：LOT 007)(美国One Lambda 公司);NXTypeTMNGS试剂盒(批号：LOT 002)(美国One Lambda公司);全自动核酸提取仪(中国台湾芮宝公司); ND 2000型超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司);FLEXMAP-3D型多功能高通量流式荧光点阵仪(美国One Lambda公司);3730型序列分析仪(美国ABI 公司);9700型基因扩增仪(美国ABI公司);ION S5TM测序仪(美国One Lambda公司)。
1.4.2 基因组DNA制备 按照台湾芮宝magcore?的试剂说明，采用全自动核酸提取仪提取基因组DNA。用超微量紫外分光光度计(型号：ND2000)检测DNA浓度及纯度， DNA质量浓度在20-70 mg/L，A260/A280在1.70-1.90。
1.4.3 PCR-SSOP 采 用 美 国 One Lambda 公 司 LABType SSO试剂对HLA-A、-C、-B、-DRB1、-DQB1 5 个位点进行特异性扩增。在96孔杂交板加入1.5 μL的变性液与3.0 μL的扩增产物于室温下反应10 min，加入中和液;将稀释后的磁珠加入至各孔，于60 ℃孵育15 min后加入洗液洗涤;4 000 r/min离心，甩掉上清液，再加入洗涤液，重复洗涤3次;加入配好的荧光标记，60 ℃孵育5 min，洗涤1次后加入缓冲液，转移到上机板后放入Luminex流式磁珠仪读取，结果用HLA Fusion 4.2软件判读。
1.4.4 PCR-SBT(Sanger测序) 严格按照美国Thermo Fisher Scientific 公 司 SeCoreTM 分 型 试 剂 盒 说 明 书 对 HLA-A、-C、-B、-DRB1、-DQB1 5个位点进行特异性扩增，每孔加入4 μL ExoSAP-IT纯化，纯化后的产物进行正反向测序;测序产物经醋酸乙醇沉淀法纯化后，加入15 μL 甲酰胺，95 ℃变性2 min，在ABI 3730测序仪上进行毛细管电泳。测序结果导入uTYPE7.2软件。
1.4.5 下一代测序分型(ION S5TM测序平台) (1)DNA扩增和定量：严格按照美国One Lambda公司 NXTypeTM NGS试剂盒的试剂说明特异性扩增HLA Ⅰ类 (A、C、B位点)全长，Ⅱ类(DRB1和DQB1位点)扩增第2， 3外显子。使用AMPure Xp磁珠对扩增产物纯化后，用 Qubit? dsDNA HS Assay 试剂盒对产物进行定量。把Ⅰ类和Ⅱ类产物进行等摩尔混合。
(2)文库构建：应用ION ShearTMPlus试剂，把扩增产物随机片段化，片段两段接上小片段序列接头，筛选300- 1 000 bp目标片段进行2次扩增，纯化后用Agilent 2200 TapeStation最终定量，制备文库。
peStation最终定量，制备文库。 (3)乳化PCR产物：经过乳化后在40 ℃等温扩增条件下，将小片段结合在磁珠ISP上进行单克隆扩增，筛选出富集ISP珠子作为测序模板终产物，加载至Ion 530TM Chip芯片上，在ION S5测序平台上分别加入4种脱氧核苷酸，开始测序。
(4)数据分析：用TypeStream VisualTM NGS Analysis Software软件进行数据处理和分析。
1.5 主要观察指标 患者及家系成员的HLA流式分型结果、PCR-SBT分型结果、NGS全长测序结果、核苷酸和氨基酸序列比对。
2 结果 Results
2.1 PCR-SSOP分型结果 将家系中各成员的流式分型数据导入软件分析，结果见表1。患者和其父亲HLA-B位点磁珠格局异常，提示736号磁珠假阳性且调整不合理，不能指定为任意确定的等位基因型。
2.2 PCR-SBT(Sanger测序)分型结果 将序列导入 uTYPE 7.2分析软件发现，患者及其父亲HLA-B位点的测序结果无完全匹配的基因型。与最接近的B*15:09:01， B*46:01/B*15:09:01，B*48:01基因型相比，均存在5个碱基突变点，患者及父亲的碱基突变点位置相同，分别位于第3外显子的第486位和第583位，第4外显子的第636位、第652位和第756位，见图1。
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2.3 下一代测序分型技术 NGS对HLA Ⅰ类位点全长进行测序，发现患者和父亲均携带1个HLA-B新等位基因，新等位基因序列完全相同。与同源性最高的等位基因 B*15:09:01相比，新等位基因在第3和第4外显子上存在5 个碱基突变，突变点位置分别为第486位G→C、第583位 T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T，与 Sanger法检测的突变点位置一致，见图2。导致了5个相应密码子发生改变，其中3个属于同义突变，编码氨基酸不发生改变，分别为第138位苏氨酸(Thr)、第188位组氨酸(His) 和第228位苏氨酸(Thr);另外2个碱基替换为错义突变，第 171位密码子编码的氨基酸由酪氨酸(Tyr)变为组氨酸 (His)，第194位密码子编码的氨基酸由异亮氨酸(Lle)变为缬氨酸(Val)。同时，NGS检测出新基因与HLA-B*15:435 相比存在11个内含子及2个3′UTR的碱基突变，其中第3内含子有3个点突变，第4内含子有2个点突变，第5内含子有 6个点突变。碱基突变位置分别为：第1 211位G→A、第1 215 位G→C、第1 468位C→A、第1 871位G→C、第1 916位 A→G、第2 233位A→G、第2 242位G→A、第2 274位C→T、第2 377位C→T、第2 414位T→G、第2 449位T→C、第 2 910位G→T、第2 978位C→T。在NGS分析软件上序列图谱见图3和图4。
2.4 命 名 新 基 因 序 列 已 递 交 给 Genbank 数据库 (MG595995)，并于2017年12月被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435。
2.5 家系调查分析 根据基因测序分型结果分析，患者 HLA-B*15:435新等位基因遗传于父亲。其母亲及2位同胞姐妹HLA配型结果均在中国常见及确认的HLA等位基因表 (CWD)中，2位同胞姐妹未遗传父亲含有新等位基因的单倍型。家系成员的单倍型见表2。
3 讨论 Discussion
HLA-B是HLA经典Ⅰ类抗原，编码的蛋白质产物以糖蛋白的形式几乎表达于所有有核细胞膜表面，通过呈递自身或异体抗原给CD8+ T细胞，在自我识别、调节免疫反应和对异体移植排斥中发挥重要作用[8-10]。HLA-B全长包含7个外显子和6个内含子，是目前HLA系统中多态性最复杂的基因座。目前IPD-IMGT/HLA数据库(3.34版，2018-10)中 HLA-B基因有5 590个等位基因，其中超过60%的等位基因缺少全长序列。作者发现的新等位基因HLA-B*15:435与同源性最高的等位基因HLA-B*15:09:01相比，在第3、4外显子上存在5个碱基差别，分别是第486位G→C、第583位 T→C、第636T位→C、第652位A→G和第756位C→T，5 个突变点均为外显子多态性位点。突变导致了5个相应密码子发生改变，由于遗传密码子的简并性，其中3个密码子编码的氨基酸不发生改变，另外2个碱基替换为错义突变，第 171位密码子编码的氨基酸由酪氨酸(Tyr)变为组氨酸 (His)，第194位密码子编码的氨基酸由异亮氨酸(Lle)变为缬氨酸(Val)。由于HLAⅠ类第2，3外显子分别编码a重链的a1和a2结构域，而a1和a2共同组成抗原肽结合槽，因此，第3外显子第171位氨基酸的改变，可能改变抗原肽的结合能力及TCR识别作用，从而引起不同的免疫应答。应用下一代测序技术进一步分型发现，该新基因与 HLA-B*15:09:01相比同时存在11个内含子和2个3′UTR非翻译区的碱基突变，这在以往国内外关于新基因的报道中是少见的[11-15]。有趣的是，HLA-B*15组等位基因内含子区域同源性较高，而该新基因11个内含子突变碱基与大部分 B*15 组 的 等 位 基 因 不 同 ， 但 是 与 HLA-B*15:20 ， HLA-B*15:228相比，这11个内含子突变位置及碱基变化完全一致。进一步分析发现，新基因与B*15组HLA-B*15:20， HLA-B*15:228 及 其 他 组 的 HLA-B*35:01:01:01 、 HLA-B*51:01:01:01、HLA-B*53:01:01:01、HLA-B*58:01: 01:01从第3内含子开始到第7外显子区域基因序列完全一致，但是在其他区域与B15的同源性较高。内含子在过去被认为不编码基因片段，在临床和科研工作中容易被忽视。近几年的研究认为，内含子可能影响剪切体的产生，进而影响HLA分子结构和表达水平[16]。最新的研究发现，HLA-B 第4内含子编码微小RNA，这些微小RNA在体外影响多个转录本的表达，影响各种新陈代谢途径和免疫应答网络[17-18]。该新基因的碱基突变是否引起功能变化，尚有待进一步研究。
国内外学者的研究表明，HLA-B与疾病有着非常紧密的联系。HLA-B27经过几十年的研究与临床实践，发现与强直性脊柱炎有极强的关联性，大于90%的患者携带该基因[19-21]。谢彦昕等[22]通过Meta分析，认为HLA-B*37和 HLA-B*46 是 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 的 易 感 性 基 因 ， 而 HLA-B*39恰巧相反，是其保护性基因。EYIOL等[23]发现 HLA-B35、HLA-B44等位基因与风湿性心脏病密切相关。以上文献表明，HLA在多种疾病中扮演重要的角色，准确分型是研究和临床应用的基础。目前HLA常规分型检测方法主要是PCR-SSOP和PCR-SBT。PCR-SSOP应用特异性寡核苷酸探针与扩增后的PCR产物杂交，适合大样本 HLA分型初筛。但PCR-SSOP无法直接反映基因序列，在阴性和阳性磁珠上的探针荧光强度处于临界值时可能出现误 判 [24-27] 。 随 着 中 华 骨 髓 库 入 库 标 准 逐 年 提 高 ， PCR-SSOP由于检测的外显子有限，出现模棱两可的基因型较多，不能完全满足中华骨髓库志愿者HLA分型入库的标准。基于3730测序仪的SBT检测方法原始读长可超过 1 000 bp，原始数据的准确率高达99%，是目前HLA分型的金标准[28]。商品化试剂盒HLA Ⅰ类位点一般检测第2，3， 4外显子，DQB1检测第2，3外显子，DRB1检测第2外显子，模棱两可的基因型需加做其他外显子或PCR-SSP加以鉴别。此例临床样本在常规PCR-SSOP分型时发现，HLA-B 存在一个假阳性的珠子，无完全匹配的结果，疑似为新基因，但无法判断基因序列变化。应用PCR-SBT对患者 HLA-B测序，无完全匹配的基因型，与最接近的基因型 B*15:09:01，B*46:01相比，有5个碱基突变，但无法确认突变的碱基具体位于哪一条染色体。联合NGS全长测序，证实该HLA-B*15等位基因第3、4外显子存在5个碱基突变，内含子区域和3′UTR非翻译区共存在13个碱基突变，从而鉴定了一个HLA-B新等位基因。NGS采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，将所有短的单体型DNA片段序列与数据库参考序列比对，通过拟合计算，拼接成完整的全长序列。该技术极大地降低了模棱两可的可能，在临床、骨髓库及科研样本HLA分型的高通量测序中具有较好的应用前景和实用价值[29-30]。
采集患者一级亲属的血样做家系分析发现，患者新基因来源于其父亲，单倍型为A*11:01-C*14:02-B*15:435- DRB1*04:04-DQB1*03:02，说明携带新基因的单倍型能稳定遗传。先证者为南方汉族急性髓细胞白血病患者，女性，其父亲为南方汉族健康人群。基因突变是否与疾病存在关联性尚有待研究。作者所在实验室已入库的59 496人份中华骨髓库南方汉族人群HLA分型数据中均未发现新等位基因HLA-B*15:435，推断该基因为低频基因。由于无法追溯，该基因的起源、多态性形成机制、单倍型是否具有紧密连锁关系等尚且未知，有待进一步的研究。
