摘要背景：人尿源性干细胞是近年来新发现的成体干细胞，其来源不受限制，提取简便，具备良好的增殖能力及多向分化潜能，近年来已应用于泌尿系疾病中的神经功能修复，如应激性尿失禁以及膀胱输尿管返流等。目的：探索人尿源性干细胞向神经元样细胞诱导分化能力及对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法：体外获取人尿源性干细胞后利用流式细胞仪检测其细胞表型，将人尿源性干细胞向神经元样细胞诱导后进行免疫组织化学染色鉴定。采用Allen方法制作大鼠T9节段脊髓损伤模型，24只SD大鼠被随机分为2组：脊髓损伤组和人尿源性干细胞组，每组12只。人尿源性干细胞组在脊髓损伤后第1天于损伤脊髓边缘注入2μL细胞浓度为1.0×1011L-1人尿源性干细胞，脊髓损伤组注入等量含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液，于造模后第1，10，20，30天进行BBB评分，第30天取各组损伤脊髓组织分别进行LuxolFastBlue染色、小胶质细胞/巨噬细胞染色和胶质纤维酸性蛋白染色，并计算损伤脊髓面积和胶质纤维酸性蛋白荧光强度。结果与结论：①人尿源性干细胞高表达CD29、CD90，而低表达CD45，并且在体外可向神经元样细胞诱导分化;②造模后第1，10天两组大鼠BBB评分差异无显著性意义(P>0.05)，第20，30天人尿源性干细胞组BBB评分明显高于脊髓损伤组(P<0.05);③人尿源性干细胞组脊髓损伤面积明显低于脊髓损伤组(P<0.05)，胶质纤维酸性蛋白染色显示人尿源性干细胞组荧光强度明显低于脊髓损伤组(P<0.05);④结果表明，人尿源性干细胞能向神经元样细胞分化，并对大鼠脊髓损伤具有修复作用。
关键词：脊髓损伤;人尿源性干细胞;神经修复;BBB 评分;胶质纤维酸性蛋白;国家自然科学基金
0引言Introduction
脊髓损伤后神经细胞缺失及损伤局部微环境改变、氧化应激和炎症介入，导致脊髓很难出现自发性的功能和结构恢复[1]。目前，国内外对于脊髓损伤的研究都极为重视，组织工程是研究脊髓损伤中最为重要的环节，在种子细胞选择方面，已有神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞以及嗅鞘细胞、许旺细胞等应用于动物脊髓损伤修复中，以上细胞对于动物脊髓损伤具有一定的修复作用，但目前还没获得满意效果[2]。因此，需要寻求一种新的具有神经修复作用的种子细胞显得十分必要。
人类尿液中存在多种细胞，大体可分为3类：终末分化细胞、具有增殖能力的不完全成熟细胞和未分化的前体细胞，后两者具有贴壁作用，可利用贴壁法提取，不完全成熟细胞数量较少，约占0.1%，在传代中数量逐渐减少，前体细胞具有较强的自我增殖能力和多向分化能力，即为人尿源性干细胞(humanurine-derivedstemcells，hUSCs)。人尿源性干细胞是近年来新发现的成体干细胞，可能是细胞治疗或组织工程中一种具有应用前景的种子细胞，其来源不受限制，提取简便。研究显示，100mL尿液可提取3个人尿源性干细胞，经传代培养2周可获取1.0×104个细胞。人尿源性干细胞还具备良好的增殖能力及多向分化潜能，已逐渐引起学者的青睐，近年来已应用于泌尿系疾病，如应激性尿失禁以及膀胱输尿管返流等[3-4]。已有研究报道，人尿源性干细胞联合硫酸软骨素酶ABC(chondroitinasesulfateABC，chABC)对大鼠脊髓损伤进行干预，已取得不错的修复效果[5]。
该研究将人尿源性干细胞在体外向神经元样细胞诱导分化，然后移植到脊髓损伤大鼠体内，观察人尿源性干细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计体外细胞学实验联合体内实验。
1.2时间及地点实验于2017年1月至2018年6月在武汉大学动物实验中心完成。
1.3材料
1.3.1实验动物SPF级SD大鼠24只，6-8周龄，雌雄各半，体质量250-270g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(鄂)2013-0004;所有动物均符合武汉大学人民医院伦理委员会对动物实验的要求和规定，所有动物进入实验前适应性喂养1周。
1.3.2实验试剂、仪器Allen打击器(武汉大学人民医院实验动物中心提供)。低糖DMEM、胎牛血清、PBS、甲苯胺蓝染液、茜素红染液(Sigma公司，美国);抗β微管蛋白(Anti-betaⅢTubulin，β-tubulin3)单克隆抗体、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)多克隆抗体(Abcam公司，美国);小鼠抗兔二抗(中杉金桥公司，中国);戊巴比妥钠(百奥莱博公司，北京);荧光倒置显微镜(Olympus公司，日本);流式细胞仪(BectonDickinson公司，美国);DAB显色试剂盒(SantaCruz公司，美国);ImageProPlus6.0软件(MediaCybernetics公司，美国)。
1.4实验方法
1.4.1人尿源性干细胞的分离培养及多向分化收集15-30岁健康男性尿液，供者及家属均知情同意。
留取尿液前充分清洗尿道，无菌条件下收集中段尿液300mL，按照文献[6]的方法，取100mL尿液加入5mL含8×105U青霉素、1×106U链霉素的双抗，充分混匀后，以500×g离心15min后弃上清液，PSB混匀后再次以500×g离心15min，弃上清后用5mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，置于培养箱中2h，提取原代人尿源性干细胞，利用0.25%胰蛋白酶消化传代，将第3代人尿源性干细胞分别向成软骨、成骨方向诱导并利用甲苯胺蓝染色和茜素红染色鉴定。根据文献[7]的方法，将人尿源性干细胞向成神经方向诱导并利用β-tubulin3免疫组织化学染色鉴定。
1.4.2流式细胞仪检测人尿源性干细胞表型取第3代人尿源性干细胞，消化、离心，制成细胞浓度为2.0×1012L-1的单细胞悬液转移至流式管中，根据文献[8]的方法，利用流式细胞仪对表面标记物CD29、CD90和CD45进行检测。
1.4.3实验分组及干预24只SD大鼠随机分为2组：脊髓损伤组和人尿源性干细胞组，每组12只。大鼠通过腹腔注射质量分数为3%戊巴比妥钠麻醉，咬除T8-10椎板，暴露T9段脊髓。采用Allen法将10g打击锤固定于脊髓上方7cm高度(致伤量为70g/cm)。
脊髓损伤模型成功的标志：在Allen装置撞击脊髓的瞬间，动物身体抖动，双下肢迅速发生回缩及弹动动作，尾巴翘起并迅速倒下，打击局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，术后双下肢出现完全瘫痪说明造模成功。
造模后均进行单笼饲养，人工辅助排尿。人尿源性干细胞组在脊髓损伤后第1天于损伤脊髓边缘注入2μL细胞浓度为1.0×1011L-1原代人尿源性干细胞，脊髓损伤组在脊髓损伤后第1天于损伤脊髓边缘注入等量含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液。
1.5主要观察指标
1.5.1后肢运动功能评分观察各组大鼠术后存活、切口愈合情况。造模后第1，10，20，30天采用BBB评分评价大鼠后肢运动功能。根据大鼠后肢各关节活动、后肢的步态和协调功能、运动时爪子的精细运动进行评分;总分为0分表示完全瘫痪，21分为完全正常活动。以左、右两侧肢体评分均值作为最终评分。
1.5.2组织学及免疫组织化学染色取术后30d各组脊髓组织约10mm，100g/L多聚甲醛固定48h，石蜡包埋，从损伤脊髓中心部位纵切面连续切片，片厚5μm。取部分切片行LuxolFastBlue和小胶质细胞/巨噬细胞染色，倒置相差显微镜下观察脊髓组织和神经元细胞的形态学改变并计算损伤面积(mm2)。余切片行胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色，荧光显微镜下观察，每张切片随机取3个视野，利用ImageProPlus6.0软件检测胶质纤维酸性蛋白荧光强度。
1.6统计学分析采用SPSS19.0(IBM公司，美国)统计软件进行分析。数据以x_±s表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Posthoc分析;两组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。
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2结果Results
2.1人尿源性干细胞的形态学观察及鉴定结果原代人尿源性干细胞呈椭圆形、梭形或不规则形，增殖能力强，传代后细胞分化成熟，胞质向周围伸展，胞体呈长梭形，传至第3代后出现均一细胞集落，并呈漩涡样生长，见图1A。人尿源性干细胞成软骨诱导21d后甲苯胺蓝染色可见胞质蓝染，见图1B;成骨诱导21d后茜素红染色可见红染的钙化灶，见图1C;向神经元样细胞诱导96h后可见部分细胞胞质向四周放射，见图1D;β-tubulin3染色可见绿染的抗微管蛋白，见图1F。经流式细胞仪检测结果显示，第3代人尿源性干细胞高表达CD29、CD90，表达率为(98.34±0.57)%，(99.31±0.23)%，而低表达CD45，表达率为(1.88±0.16)%，见图2。
2.2各组大鼠后肢运动功能评分术后各组大鼠均存活，切开无红肿等感染表现。术后第1，10，20，30天，两组大鼠BBB评分逐渐增高，第1，10天两组大鼠BBB评分差异无显著性意义(P>0.05)，第20，30天人尿源性干细胞组BBB评分明显高于脊髓损伤组(P<0.05)，见表1。
2.3组织学观察结果LuxolFastBlue染色及小胶质细胞/巨噬细胞染色显示，脊髓损伤组神经元细胞肿胀坏死，严重的脱髓鞘样改变，并出现较多炎性细胞浸润，脊髓中央出现空洞，缺损面积较大;人尿源性干细胞组神经元细胞肿胀，少量炎性细胞浸润，脱髓样改变明显减少，脊髓中央空洞较小，缺损面积较小。半定量分析显示，脊髓损伤组脊髓缺损面积为(6.71±0.96)mm2，人尿源性干细胞组脊髓缺损面积为(2.86±0.74)mm2，人尿源性干细胞组脊髓缺损面积显著低于脊髓损伤组(P<0.05)，见图3。
2.4免疫组织化学染色观察结果脊髓损伤组胶质纤维酸性蛋白主要集中于脊髓损伤区表达，其中损伤边缘胶质界膜边界清晰，损伤区内部空洞形成;而人尿源性干细胞组脊髓损伤区可见少量胶质纤维酸性蛋白阳性表达，损伤区内部空洞较小。脊髓损伤组荧光强度值为14.67±1.09，人尿源性干细胞组荧光强度值为1.86±0.79，人尿源性干细胞组胶质纤维酸性蛋白荧光强度显著低于脊髓损伤组(P<0.05)，见图4。
3讨论Discussion
3.1人尿源性干细胞生物学特征人尿源性干细胞来源于尿液，是一类具有良好自我增殖和多向分化潜能的成体干细胞，人尿源性干细胞通过旁分泌/自分泌机制减轻肾脏细胞和组织损伤，已知间充质干细胞可以分泌大量具有抑制凋亡、修复细胞损伤的可溶性因子，包括表皮生长因子、重组人神经胶质源神经营养因子、血管内皮生长因子、血小板衍生因子和胰岛素样生长因子结合蛋白等[9-10]。由于人尿源性干细胞具有来源不受限制，制备过程简便，安全无创和成本低等特点，在细胞替代疗法和组织工程研究中更具优势，而目前国内外对于人尿源性干细胞的研究尚处于初期阶段。
研究显示，第1-4代人尿源性干细胞能高表达细胞表面抗原决定簇CD90、CD105、CD44和CD29，而低表达CD31、CD45、CD133和CD117，细胞表面抗原决定簇能决定细胞的生物学特性[11]。因此，为进一步验证人尿源性干细胞生物学特性，该研究首先将人尿源性干细胞在体外分别向成软骨、成骨、神经元样细胞诱导，发现其能向软骨、骨及神经元样细胞分化，提示人尿源性干细胞具有多向分化潜能。通过流式细胞仪检测细胞表型，发现人尿源性干细胞高表达CD29和CD90，而低表达CD45，提示人尿源性干细胞具有和其他间充质干细胞相似的生物学特性，因此，进一步设想人尿源性干细胞对于脊髓损伤具有一定促进修复作用。
3.2人尿源性干细胞治疗脊髓损伤成体干细胞治疗脊髓损伤已有较多报道，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人脐血间充质干细胞以及神经干细胞等对于脊髓损伤均有保护作用[12-13]。对于人尿源性干细胞，目前研究多集中于泌尿系疾病，如阴茎海绵体局部神经损伤后导致勃起功能障碍[14]。人尿源性干细胞在体内可分泌血管内皮生长因子促进裸鼠神经对肌肉支配，改善压力性尿失禁小鼠神经支配功能[15]。对于脊髓损伤的研究尚未有研究报道，该实验通过Allen法构建大鼠脊髓损伤模型，发现脊髓损伤大鼠后肢运动功能明显受到抑制，经移植人尿源性干细胞后，后肢运动功能明显好转，提示人尿源性干细胞可改善脊髓损伤大鼠后肢的运动功能。
脊髓损伤具有高发病率及高致残性的特点，是较为棘手的临床常见疾病，可造成患者神经功能永久性障碍[16-17]。脊髓损伤发生后巨噬细胞聚集、激活并释放一系列炎性或氧化应激因子，这些细胞因子能够促使星形胶质细胞和小胶质细胞发生迁移，同时促使星形胶质细胞增殖、肥大，并产生胶质丝和突起，促进神经元细胞变性坏死，最终导致胶质瘢痕形成[18-22]。既往研究已证实胶质瘢痕是影响轴突再生和中枢神经系统损伤后功能恢复的主要障碍[23-25]。该研究中，脊髓损伤后神经元细胞肿胀坏死，严重的脱髓鞘样改变，并出现较多炎性细胞浸润，脊髓中央空洞形成，胶质纤维酸性蛋白荧光强度较大;而经过人尿源性干细胞移植治疗后浸润的炎性细胞明显减少，脱髓样改变也明显减少，胶质纤维酸性蛋白荧光强度减弱。
半定量分析显示，人尿源性干细胞移植治疗后脊髓损伤缺损面积和致密胶质瘢痕明显减少，提示人尿源性干细胞移植治疗可明显改善脊髓损伤，其机制可能为：人尿源性干细胞具有干细胞特性，在体外能诱导成神经元样细胞，植入脊髓损伤区域后，在神经细胞的大环境中能诱导人尿源性干细胞向神经元样细胞分化;其次，人尿源性干细胞移植后能自发分泌一些细胞营养因子，能够促进人尿源性干细胞增殖和神经营养作用[26-28];最后，人尿源性干细胞可能具有其他间充质干细胞
相似的抑制炎性反应的生物学特性，能抑制脊髓损伤后相关炎症因子的分泌[29-31]，从而发挥神经元保护作用。目前对于脊髓损伤的治疗策略多采取抑制神经元细胞凋亡以及刺激轴突再生等。对于减少炎症反应微环境及局部胶质瘢痕形成的研究较少，该研究从体外验证了人尿源性干细胞可分化为神经元样细胞并在体内可发挥促进脊髓损伤修复的作用，为神经组织工程种子细胞的选择提供了新的参考。
