摘要背景：现阶段骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2对骨髓间充质干细胞膜片增殖、成骨分化的影响和作用机制还尚未可知，如何将生长因子与组织工程细胞膜片技术相整合，最终将其用于骨缺损修复具有重要意义。目的：探讨单独及联合应用骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2对骨髓间充质干细胞膜片增殖和成骨分化的影响。方法：体外分离培养鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞并构建细胞膜片，选用不同质量浓度的骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2单独及联合诱导骨髓间充质干细胞膜片，CCK-8法结合碱性磷酸酶活性检测确定2种因子促进膜片增殖和成骨分化的最佳有效质量浓度;然后对骨髓间充质干细胞膜片进行成骨诱导，通过大体及显微镜观察、Vonkossa染色、茜素红染色、RT-PCR检测相关成骨标志物来评估诱导效果。结果与结论：单独应用骨形态发生蛋白2可增强骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性，最佳质量浓度为100μg/L(P<0.001)，单独应用碱性成纤维生长因子2能加速骨髓间充质干细胞膜片的增殖，最佳质量浓度为20μg/L(P<0.001)，而联合应用既可以促进膜片增殖又能提高其碱性磷酸酶活性(P<0.001);经成骨诱导后，4组膜片在形态学上无明显差异，均能诱导骨髓间充质干细胞膜片的成骨分化，其中联合组钙结节最明显(P<0.001)，可显著促进膜片晚期成骨分化并抑制其早期成骨分化，具有明显的协同促进作用(P<0.001)。结果表明，骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2联合应用时具有协同作用，既可以促进骨髓间充质干细胞膜片增殖，又能显著增强其成骨诱导能力。
关键词：骨形态发生蛋白2;成纤维细胞生长因子2;细胞膜片技术;细胞增殖;成骨分化
0引言Introduction
细胞膜片技术是将高密度的细胞接种在培养皿上，使其相互重叠生长，分泌大量细胞外基质而形成的透明致密膜状物[1]，自1993年由日本学者OKANO报道后，现已成为现代再生医学领域应用的热点。因其不需要酶解，从而能完整地保存细胞-基质、细胞间连接以及细胞表面相关蛋白等结构，能够显著提高细胞的利用率。近年来，该技术在皮肤[2]、肾脏[3]、牙周膜[4]、心肌等组织再生修复中已得到广泛的应用[5]。目前已有将膜片技术用于骨缺损和软骨缺损修复的实验性研究，但尚缺乏临床长期作用结果的支持[6]。此外，如何优化制备技术，如何使细胞膜片与细胞因子更好的整合，如何使细胞膜片与支架材料优势结合以及相关通路机制研究等问题，仍有待进一步深入研究。
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在诸多生长因子中，骨形态发生蛋白2(bonemorphogeneticprotein2，BMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子2(fibroblastgrowthfactor2，FGF-2)逐渐成为学者们研究的焦点。BMP-2是目前成骨诱导活性最强的生长因子，它能够不可逆地诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，增加Ⅰ型胶原的合成和骨钙素等基因的表达，进而高效地促进骨组织形成[7-8]。FGF-2对外胚层和中胚层来源的细胞有明显趋化作用，是多种细胞形态发生和分化的主要因子[9]。有文献报道，FGF-2有促进骨髓间充质干细胞增殖、迁移和分化的作用[10]。然而，BMP-2和FGF-2单独或联合应用于骨髓间充质干细胞膜片，其增殖和分化是否具有协同作用尚未可知。
实验拟用BMP-2及FGF-2单独及联合诱导骨髓间充质干细胞膜片，观察其增殖和成骨分化能力，探究其相关作用机制，以期将细胞因子、细胞膜片技术与支架材料的优势相整合，最终为细胞膜片技术应用于骨缺损修复开拓新的思路和方法。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计细胞学体外观察实验。
1.2时间及地点实验于2018年6月至2019年1月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞实验室完成。
1.3材料
1.3.1实验动物4周龄SD大鼠30只，雌雄不限，体质量40-50g，由新疆医科大学动物实验中心提供，SPF级，许可证号：SCXK(新)2016-0003。
1.3.2实验试剂和仪器α-MEM培养液(Hyclone，美国);胎牛血清(四季青，中国);ratBMP-2(Peprotach，美国);ratFGF-2(Peprotach，美国);RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国);CCK-8(Dojindo,日本);反转录试剂盒(Takara，日本);引物序列(上海生物工程公司，中国);RT-PCR仪(Bio-RAD，美国);倒置相差显微镜及拍照系统(莱卡，德国);酶标仪(Thermo，美国);超净工作台(苏州净化设备厂);CO2恒温培养箱(Thermo，美国)。
1.4实验方法
1.4.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定将SD大鼠脱颈处死后，用体积分数为75%乙醇溶液浸泡消毒5min。在无菌条件下，分离股骨和肱骨，剪开骨骺端，用5mL注射器吸培养液冲出骨髓，反复吹匀后，离心弃上清，重悬于25cm2细胞培养瓶中。首次换液于72h后，每两三天换1次液，当细胞长至85%-90%融合时，用胰酶消化并按合适的比例传代。取第2代骨髓间充质干细胞经胰酶消化计数，避光条件下，分别加入2μL的相关抗体CD29、CD45和CD44，并设立阴性对照组，于4℃孵育30min，加入1mL预冷的PBS离心洗涤2次，再加入500μLPBS吹打混匀，上流式细胞仪鉴定，取第2，3代细胞用于以下实验。
1.4.2制备骨髓间充质干细胞膜片用胰酶消化重悬细胞，以2×104个/孔的密度接种到24孔板中，每孔加入α-MEM培养液1mL，每2d换液1次。待板内细胞融合至100%时，更换培养液为成膜诱导液(α-MEM+体积分数为10%胎牛血清+1%谷氨酰胺+50μmol/L维生素C+1%青链霉素)，每2d换液1次。
1.4.3骨髓间充质干细胞膜片的增殖活性培养5-7d后骨髓间充质干细胞膜片形成，用不含血清的α-MEM培养液饥饿24h，再更换为含体积分数为10%胎牛血清、5%双抗、5%谷氨酰胺的α-MEM完全培养液，然后加入生长因子：BMP-2组和FGF-2组分别添加不同质量浓度的BMP-2(50，100，200μg/L)和FGF-2(5，10，20μg/L)，联合组添加100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2(同时加入，无先后顺序)，对照组仅添加α-MEM完全培养液(不含BMP-2和FGF-2)，培养3，7d，每组3个复孔。按CCK-8试剂盒说明操作，在酶联仪450nm光波下测定吸光度值并记录。
1.4.4骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性按上述方法添加不同质量浓度BMP-2和FGF-2诱导3，7d后，PBS冲洗1次，0.1%TritonX-100裂解细胞膜片，反复吹打1min。按碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行操作，测定405nm波长下吸光度值。以每分钟水解para-nitrophenylphosphate显色底物产生1μmol/Lp-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。
1.4.5BMP-2及FGF-2诱导骨髓间充质干细胞膜片的成骨分化将细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔板中，按照上述方法构建细胞膜片，配制成骨诱导液(α-MEM+体积分数为5%胎牛血清+10nmol/Lβ-甘油酸钠+100nmol/L地塞米松+50μmol/L维生素C)，在实验组成骨诱导液中单独及联合添加100μg/LBMP-2、20μg/LFGF-2两种因子(同时加入，无先后顺序)，对照组仅添加成骨诱导液，每孔2mL，每3d换液1次。
(1)形态学观察：第7天时，大体及显微镜观察各组细胞膜片的生长情况和表面形态，并拍照记录。
(2)Vonkossa染色：第7，14，21天时，40g/L多聚甲醛固定膜片30min，PBS缓慢冲洗2次，加入Vonkossa银溶液，紫外线下照射5-10min，蒸馏水冲洗1min，海波溶液处理2min，镜下观察并拍照。每组重复3次。
(3)茜素红染色和半定量分析：第7，14，21天时，40g/L多聚甲醛固定30-60min，加入1%茜素红染液染5-20min，镜下观察并拍照。半定量测定：分别加入脱色液1mL溶解于10mmol/L磷酸钠溶液中，将染液完全脱下来，取上清液于450nm测吸光度值。每组重复3次。
(4)RT-PCR检测成骨相关mRNA：用Trizol法裂解4组细胞膜片，提取各组总RNA，分别测定其纯度、浓度，选择纯度值在1.8至2.0之间的总RNA，然后反转录获得cDNA，最后用PT-PCR试剂盒检测相关成骨基因(Runx2/cbfa1、BMP-2、COL-1)的表达量，引物序列见表1。通过公式X=2-ΔΔCt计算各实验组目的基因较对照组的相对表达水平。实验重复检测3次。
1.5主要观察指标①BMP-2及FGF-2诱导后骨髓间充质干细胞膜片增殖情况、碱性磷酸酶活性;②成骨分化后骨髓间充质干细胞膜片形态、Vonkossa染色、茜素红染色和半定量分析以及相关成骨标志物Runx2/cbfa1、BMP-2、collagen-1的表达。
1.6统计学分析实验数据均用x_±s表示，运用SPSS24.0软件进行多组间one-wayANOVA分析，组内数据比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
2结果Results
2.1骨髓间充质干细胞的表型鉴定结果流式细胞术鉴定大鼠骨髓干细胞表面标志物，间充质干细胞抗原CD29(82.4%)呈阳性表达，造血干细胞抗原CD45(2%)呈阴性表达，以上结果皆符合间充质来源的干细胞特征，见图1。
2.2骨髓间充质干细胞膜片的增殖情况与对照组相比，单独应用BMP-2对骨髓间充质干细胞膜片的增殖无明显影响，与时间和浓度均无关(P>0.05);而单独应用FGF-2能明显促进骨髓间充质干细胞膜片的增殖(P<0.01)，呈时间和浓度依赖性，培养至第7天时，3个质量浓度中20μg/L为最佳有效质量浓度(P<0.001);联合组(100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2)在第3天和第7天时，促进膜片增殖的能力明显高于同一时间内二者单独应用组(P<0.001)，并与时间呈相关性，见图2。
2.3骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性与对照组比较，单独应用BMP-2可明显促进骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性(P<0.01)，其效应会随着BMP-2质量浓度的增加而逐渐增强，当质量浓度为100μg/L时，膜片的碱性磷酸酶活性最强(P<0.001)，且具有时间依赖性;单独应用FGF-2也可提高细胞膜片的碱性磷酸酶活性(P<0.01)，但不受质量浓度变化的影响;而联合应用100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2可显著提高骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性(P<0.001)，并与时间呈相关性，见图3。
2.4骨髓间充质干细胞膜片成骨分化后的形态变化体外培养7d后，在6孔板底部可见4组膜片均形成半透明薄膜样结构，边缘有褶皱形成，质地柔软，可用镊子沿板的边缘完整揭起。在倒置相差显微镜下观察，4组膜片均呈复层生长并含有大量细胞外基质，这表明单独或联合应用BMP-2和FGF-2对膜片的形态结构无影响，见图4。
2.5骨髓间充质干细胞膜片成骨分化后Vonkossa染色结果对于胞浆内钙盐的沉积，在第7天时，对照组几乎无变化，联合组、BMP-2组和FGF-2组的钙盐开始逐渐沉积，其中联合组最明显，呈黑褐色。第21天时，联合组胞浆中钙盐沉积最多，颜色最深，见图5A。
2.6骨髓间充质干细胞膜片成骨分化后茜素红染色和半定量分析在相同的时间内，联合组的成骨诱导能力最强，有大量片状暗红色钙结节形成，此外，BMP-2组较FGF-2组明显，对照组虽有红色钙结节出现，但相对较少，随着成骨诱导时间的增加，各组钙化面积也明显增大，见图5B。对骨髓间充质干细胞膜片表面钙结节半定量分析：联合组是对照组的1.4-2.0倍，是BMP-2组和FGF-2组的1.1-1.6倍，见图6。
2.7骨髓间充质干细胞膜片成骨分化后成骨基因的表达成骨诱导7d后，与对照组相比，联合组、BMP-2组和FGF-2组骨髓间充质干细胞膜片中COL-1的表达降低，联合组表达量下降明显(P<0.001);同时BMP-2和Runx2/cbfa1的表达显著增加(P<0.001)，其中联合组表达量最高，说明BMP-2和FGF-2均能促骨髓间充质干细胞膜片的成骨分化，其中联合组具有显著的协同诱导作用，见图7。
3讨论Discussion
随着组织工程细胞膜片的相关研究与日俱进，采用外源性生长因子对细胞膜片进行修饰，以长期高效的促进骨组织愈合具有广泛的研究前景。骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、神经和脂肪的能力，是重要的种子细胞来源[11-12]。实验以骨髓间充质干细胞作为种子细胞，经流式细胞术鉴定其表面间充质干细胞抗原CD29(82.4%)呈阳性表达，造血干细胞抗原CD45(2%)呈阴性表达，符合间充质来源的干细胞特征，该方法快速稳定且不易影响细胞活性，是鉴定细胞的有效方法。
现阶段BMP-2和FGF-2对细胞增殖、分化的研究结果不尽相同，导致这种差异的原因一方面与作用细胞的不同有关，另一方面也受培养环境的影响[13-14]。众所周知，生长因子发挥生物效应很大程度上受其浓度影响，同时定量检测碱性磷酸酶能够直接反映成骨分化的早期情况，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化越明显[15]。因此，该实验应用不同质量浓度的BMP-2和FGF-2诱导骨髓间充质干细胞膜片，结果显示，联合应用时具有协同诱导膜片增殖和成骨分化的作用，单独应用FGF-2能加速膜片的增殖，而单独应用BMP-2对膜片增殖活性基本无影响，但均能促进膜片的成骨分化。有些研究认为，FGF-2存在低浓度促进、高浓度抑制细胞增殖活性的作用[16]，这可能与细胞种类和生长因子的处理方式不同有关。该实验参考张戎[13]和PALIOTO等[17]提供的方法，确定了单独及联合应用BMP-2和FGF-2促进细胞膜片增殖和成骨的最佳质量浓度，即100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2，并用于后续实验。
细胞膜片技术最早是由日本学者OKANO等利用温敏培养皿制备出来的，目前常用的膜片制备技术包括温度感应式培养技术、外科剥离和维生素C诱导法。有学者报道称维生素C诱导法制备细胞膜片简单方便，有着更好的生物学和机械性能[18]。因此，该实验也采用维生素C诱导法，从而简单有效地获得了骨髓间充质干细胞膜片，也验证了此方法的可行性。根据实验分组，采用100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2连续诱导细胞膜片，于第7天在板底部均可见4组膜片形成乳白色半透明薄膜样结构，边缘有褶皱形成，质地柔软，沿着边缘可完整揭起，同时通过显微镜观察都含有丰富的细胞外基质，这表明用生长因子诱导骨髓间充质干细胞膜片不会影响其形态结构。
由于BMP-2有很强的成骨诱导能力，而FGF-2能促进细胞增殖和血管再生，二者参与骨形成的作用机制不同，但存在协同效应，目前已有研究将其联合用于骨缺损的再生与修复中[19-20]。钙结节的形成能够直观反映骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的程度，是细胞成骨分化进入到矿化阶段的有力证据。该实验通过vonkossa染色、茜素红染色来鉴定钙结节，以此对比分析BMP-2和FGF-2诱导骨髓间充质干细胞膜片的成骨分化程度。结果发现，BMP-2组的钙结节均较FGF-2组增多，联合组则有大量的片状钙结节形成，呈黑褐色或暗红色;同时，半定量结果指出联合组的钙结节数量是BMP-2组和FGF-2组的1.1-1.6倍，是对照组的1.4-2.0倍，从而直观而准确地反映了随时间变化二者可使钙盐沉积并逐渐形成类骨质。这与QI等[21]的研究结果一致。但也有文献报道，当FGF-2质量浓度高于10μg/L时，FGF-2会与其表面受体和细胞外基质之间达到饱和状态[22]，钙结节的数量不会再随质量浓度升高而继续增多，因而制约了对骨髓间充质干细胞成骨诱导的作用。在此实验中FGF-2的有效质量浓度可达到20μg/L，这可能与骨髓间充质干细胞膜片表面存在大量的细胞外基质、丰富的连接蛋白(如离子通道、生长因子受体等)和受体功能的高超高含量耐受性有关，从而使BMP-2和FGF-2充分发挥了对骨髓间充质干细胞膜片的成骨诱导作用。
RT-PCR结果显示，FGF-2及BMP-2能够促进膜片成骨基因的表达，在第7天时COL-1呈下降趋势，而Runx2/cbfa1、BMP-2出现上升趋势。COL-1通常出现在成骨的早期阶段，由成骨细胞合成、分泌纤维胶原成分[23]，这说明联合组、BMP-2组和FGF-2组可能逐渐进入成骨分化的中晚期阶段，而晚期成骨基因BMP-2的表达量显著增高恰好可以说明这一点。然而，骨转录因子Runx2/cbfa1会出现晚期抑制成骨分化的作用，但在此实验中Runx2/cbfa1呈上升趋势。有研究证实，BMP-2能与细胞表面受体BMPRs结合来激活Smad1/5/8信号通路从而上调FGF-2和Runx2/cbfa1的表达[24-25];而FGF-2通过与表面受体FGFRs结合经Ras/MAPK/ERK信号通路来激活Runx2/cbfa1、BMP-2及其受体BMPRs[26]，也就是说，实验中的BMP-2和FGF-2可能通过与膜片表面分泌的大量生长因子受体相互作用协调，紧接着激活Smad信号通路和Ras/MAPK/ERK信号通路，从而上调了Runx2/cbfa1的表达，最终促进骨髓间充质干细胞膜片的成骨分化，因此实验中Runx2/cbfa1呈上升趋势。通过比较各组COL-1、Runx2/cbfa1、BMP-2的表达量可以推测，联合组是通过调节二者间错综复杂的信号通路，来完成协同诱导作用，最终显著促进细胞膜片向成骨细胞的分化。
综上所述，BMP-2及FGF-2联合应用时具有协同作用，既可以促进骨髓间充质干细胞膜片的增殖，又能显著增强其成骨诱导能力，为生长因子在细胞膜片技术中的应用提供了新的思路和方法，后期课题组将从蛋白水平和动物体内实验继续进一步研究，以期在相关通路机制、生长因子与组织工程细胞膜片优势结合等关键性问题上有所突破，使其真正的发挥临床作用，仍需要不懈的努力。
