摘要背景：补骨脂素是属于植物类雌激素，有大量研究证实其具有促进细胞增殖分化的作用。目的：应用补骨脂素、兔骨内膜间充质干细胞和聚己内酯支架构建人工复合骨，探讨其治疗兔骨不连的效果。方法：①将第3代兔骨内膜间充质干细胞接种于细胞培养板中，分别加入10-8，10-7，10-6mol/L补骨脂素、50mg/L骨形态发生蛋白2进行干预，对照组加入同体积的无菌纯净水。干预第3，5，7天采用MTT法检测细胞增殖情况;②将聚己内酯三维支架加入到细胞培养板底部，兔骨内膜间充质干细胞按1×103/孔的量接种于支架上，然后加入10-6mol/L补骨脂素，联合培养21d后取出即为人工复合骨;③27只新西兰大白兔随机均分为3组，建立桡骨骨不连模型，实验组植入人工复合骨，支架组单纯植入支架，对照组不植入任何材料。术后2，4，8周行病理学苏木精-伊红染色，观察成骨情况。术后第4周拍摄X射线片，观察骨不连愈合情况。结果与结论：①3种浓度补骨脂素均有诱导兔骨内膜间充质干细胞增殖的作用，与对照组比较，10-6mol/L补骨脂素对兔骨内膜间充质干细胞刺激作用最强(P<0.05)，而且10-6mol/L补骨脂素组与阳性对照骨形态发生蛋白2组相比差异无显著性意义(P>0.05);②新西兰大白兔桡骨中段骨不连组织苏木精-伊红染色结果显示，实验组成骨细胞数目明显多于支架组和对照组(P<0.05);③X射线片结果显示，实验组骨不连已经愈合，支架组骨折部分愈合，对照组骨不连未愈合;④结果表明，补骨脂素对兔骨内膜间充质干细胞增殖作用与浓度有一定的相关性。补骨脂素可结合兔骨内膜间充质干细胞及聚己内酯支架形成人工复合骨，通过动物实验证实其治疗骨不连效果较好。
关键词：补骨脂素;兔骨内膜间充质干细胞;细胞增殖;细胞支架;骨不连
0引言Introduction
骨不连在临床实际工作中比较常见，其治疗主要包括物理疗法、生物疗法和手术治疗。物理疗法包括体外冲击波治疗、低频脉冲治疗、电刺激疗法等;生物疗法包括骨生长因子治疗、骨髓和干细胞移植治疗、骨组织工程治疗;手术治疗包括骨移植、内固定治疗、外固定治疗等。越来越多学者认为骨组织工程治疗骨不连是医学发展的趋势，并且有独特的效果。
补骨脂素来源于豆科植物补骨脂，是一种植物类雌激素，有研究表明补骨脂素对细胞增殖有一定的功效[1]。聚己内酯是一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料，受到研究学者的广泛重视[2]。兔骨内膜间充质干细胞分离自骨膜，是一种有自我更新和分化能力的骨膜细胞。实验采用补骨脂素诱导兔骨内膜间充质干细胞扩增后植入聚己内酯三维支架中构建人工复合骨，探讨人工复合骨对兔骨不连的治疗效果，为补骨脂素诱导兔骨内膜间充质干细胞增殖并运用于骨组织工程提供实验依据。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计细胞学体外实验和随机对照动物实验。
1.2时间及地点实验于2018年6至12月在广州中医药大学分子生物实验室完成。
1.3材料补骨脂素(上海士锋生物科技有限公司);胰蛋白酶(上海嵘崴达实业有限公司);兔骨内膜间充质干细胞(武汉巴菲尔生物技术服务有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma，美国);二甲基亚砜(北京百奥莱博科技有限公司);DMEM-F12培养基(Gibco，美国);聚己内酯三维支架(上海研谨生物科技有限公司);抗坏血酸、地塞米松(上海嵘崴达实业有限公司);倒置相差显微镜(Olympus，日本);二氧化碳恒温培养箱(Thermo，美国);自动酶标分析仪(北京科瑞美科技有限公司);细胞培养板(上海嵘崴达实业有限公司);超净工作台(北京佳源兴业科技有限公司)。
实验动物：新西兰大白兔27只，体质量约1.5kg，雌雄不限，由广州中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2018-0149。
1.4实验方法
1.4.1兔骨内膜间充质干细胞培养兔骨内膜间充质干细胞购买自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，购买后接种于含DMEM-F12培养基的细胞培养皿中常规培养，每3d换液1次，显微镜下观察细胞增殖情况，当细胞增殖到铺满培养皿底部时，即用0.25%胰蛋白酶消化，传代继续培养，第3代细胞用于后续实验。
1.4.2补骨脂素诱导兔骨内膜间充质干细胞增殖将第3代兔骨内膜间充质干细胞接种于细胞培养板中，调整细胞浓度为1×103/孔。实验分5组，每组5个复孔，分别为补骨脂素低、中、高浓度组(10-8，10-7，10-6mol/L)、骨形态发生蛋白2组、对照组。骨形态发生蛋白2组仅加入骨形态发生蛋白2(50mg/L)，对照组加入同体积的无菌纯净水。干预第3，5，7天检测吸光度值，简略步骤：加入MTT(5g/L)20µL，置于37℃，体积分数为5%CO2恒温培养箱中培养4h，加入0.15mL二甲基亚砜，结晶溶解后检测各组吸光度值，每次重复检测3次，取均值。
1.4.3兔骨内膜间充质干细胞与聚己内酯三维支架构建人工复合骨将兔骨内膜间充质干细胞以1×107L-1细胞浓度接种于细胞培养板内，然后将聚己内酯三维支架放于细胞培养孔中，加入含有10-6mol/L补骨脂素的DMEM-F12培养液，每3d更换细胞培养液1次，第14天取出细胞支架复合物用于后续实验。
1.4.4动物骨不连模型的建立及人工复合骨的植入取27只1.5kg左右的新西兰大白兔，随机分为3组，每组9只。首先刮除下肢毛发，戊巴比妥钠麻醉至大白兔活动无力，用手术刀分离右前肢桡骨中段的皮肤组织，暴露出骨质后，剪除一整段约1.5cm的骨质，实验组植入人工复合骨，支架组单纯植入聚己内酯三维支架，对照组无植入物，术后在同一饲养环境下饲养。
1.4.5苏木精-伊红染色术后第2，4，8周，各组分别处死3只新西兰大白兔，剔除毛发，切开皮肤，分离暴露骨不连处骨质，截取0.8cm组织块，先用40g/L多聚甲醛浸润，然后用脱钙液和乙醇分别处理，脱去钙质和水分，石蜡包埋后进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察成骨细胞数量[3]。
1.4.6X射线摄片检测骨不连术后第4周，处死之前用X射线机拍片检测骨不连愈合情况(型号：warianRAD-14)，拍片设定为：管电流80mA，管电压50kV，焦距90cm，曝光时间0.3s。
1.5主要观察指标①兔骨内膜间充质干细胞增殖情况;②骨不连处病理切片形态和成骨细胞计数;③骨不连处大体X射线片观察骨愈合情况。
1.6统计学分析统计学软件用SPSS17.0，数据以x_±s表示，组内比较采用方差分析，组间差异用最小显著差异法(LSD法)，P<0.05为差异有显著性意义。
2结果Results
2.1兔骨内膜间充质干细胞增殖情况各组兔骨内膜间充质干细胞增殖见表1，图1。各组吸光度值总体均随时间延长而增加，以第7天吸光度值最大。与对照组相比，不同浓度补骨脂素组及骨形态发生蛋白2组各时间点吸光度值均升高(P<0.05);与骨形态发生蛋白2组相比，补骨脂素高浓度组吸光度值差异无显著性意义(P>0.05)，补骨脂素中浓度组及补骨脂素低浓度组吸光度值均小于骨形态发生蛋白2组(P<0.05)。
2.2实验动物数量分析
27只新西兰大白兔参加实验，中途无脱落，均进入结果分析。
2.3苏木精-伊红染色切片成骨细胞计数情况各组切片苏木精-伊红染色后成骨细胞计数见表2，图2。支架组及实验组在第2，4，8周成骨细胞逐渐增多，对照组仅第4周有所增多，第8周比第4周减少。与对照组相比，支架组和实验组在各个时间点成骨细胞数量均增多(P<0.05);与支架组相比，实验组在各个时间点成骨细胞数量均增多(P<0.05)。
2.4各组桡骨中段骨不连组织病理形态术后4周，实验组见大量新生的骨质，呈编织样，少量微血管，骨细胞散在各处骨质端，见图3A;支架组新生骨及骨细胞比实验组少，有比较多的细血管，骨折端不完全被骨质代替，见图3B;对照组显微镜下可见大量的细小血管和肉芽组织，骨细胞少，有多处钙化点，见图3C。
2.5各组术后4周影像学观察骨愈合情况实验组骨不连已经愈合，未见骨折线，骨皮质致密，骨髓腔已经贯通，骨小梁呈网格状排列，见图4A;支架组骨皮质未完全相连，髓腔部分贯通，骨折部分愈合，骨小梁存在，见图4B;对照组骨不连未愈合，骨间隙清晰存在，见图4C。
3讨论Discussion
豆科植物提取物补骨脂素用于骨组织工程的研究较少，以往研究骨组织工程治疗骨不连常常选用注射成骨因子、植入自体骨髓等方法，该研究体外培养兔骨内膜间充质干细胞，用聚己内酯支架为载体，补骨脂素为诱导刺激剂，成功构建了内含活细胞的复合人工骨。实验建立标准的动物骨不连模型，植入复合人工骨后通过切片和影像学观察其实际效果，为补骨脂素运用于骨组织工程提供一种新的思路。
补骨脂素提取自补骨脂、珊瑚菜、芸香等植物，属于香豆素类，是一种植物雌激素，有多种生物活性作用，如抗骨质疏松、抗白血病、抗子宫出血、抗哮喘、治疗骨折、促进细胞增殖等[4-5]。多位学者证实，补骨脂素有抗骨质疏松的作用[6-8]，黄奎等[9]建立大鼠骨质疏松模型，采用补骨脂素灌胃，并通过钼靶X射线及生物力学等方法证实补骨脂素能有效改善骨折愈合质量和生物学功能。杨伊姝等[10]建立了大鼠强迫游泳及悬尾等抑郁模型，用不同剂量的补骨脂素干预，发现补骨脂素有抗抑郁的效应。还有研究建立骨髓间充质干细胞培养体系，发现补骨脂素能影响Notch信号通路，从而有抗骨质疏松的作用[11]。李少鹏等[12]采用CCK-8、Westernblot、流式细胞术等方法证实补骨脂素对前列腺癌细胞的抑制作用具有剂量依赖性，说明补骨脂素有抗肿瘤作用。霍力为等[13]从乳鼠头盖骨获得骨细胞并进行体外培养，MTT法检测发现补骨脂素对乙醇诱导的成骨细胞有明显的促增殖功效。另外还有研究认为补骨脂素有抑制成骨细胞凋亡、促进成骨细胞增殖的功能[14-17]。
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细胞支架要满足多个条件[18-19]：①机体能耐受，无毒性，有良好生物相容性;②可被机体自然降解，并且降解后能被机体吸收;③有合适细胞增殖的三维空间;④有良好的可塑性，能塑形为不同的形态结构;⑤支架表面和细胞膜能有效接触，细胞可有效附着在上面。目前组织工程支架包括生物类、异种材料类、人工复合物类。生物类取材机体自身，如自体髂骨，无免疫排斥性，但对机体有明显的损伤，且无法大量获得;异种材料类包括胶原海藻、羟基磷灰石等，但有生物相容性差、无法降解、免疫排斥等缺点;聚己内酯细胞支架有可吸收降解、能塑形、细胞容易在内增殖等优点，是组织工程中有潜力的一种支架材料[2，20]。课题组通过补骨脂素持续刺激聚己内酯支架中的兔骨内膜间充质干细胞，成功构建了人工复合骨，并通过动物模型验证其性能，苏木精-伊红染色发现，实验组见大量新生的骨质，呈编织样，少量微血管，骨细胞散在各处骨质端，而纯支架组无论是骨质矿化，还是骨细胞数量均较少。说明该人工复合骨治疗骨不连，能够缩短骨愈合时间，提高成骨质量，同时也说明补骨脂素诱导兔骨内膜间充质干细胞增殖是有效获得骨组织工程种子细胞的方案。通过X射线摄片，进一步证实了组织学的结论，术后4周复合骨能完全治愈骨不连，而支架组只能使部分骨缺损愈合。
兔骨内膜间充质干细胞一般分离自四肢管状骨的骨内膜，骨内膜是一层组织膜，含有成骨细胞前体细胞、血管、神经、结缔组织等，是修复骨重要的解剖结构[21-23]。骨内膜内的间质干细胞有高度增殖、分化和更新的能力，可向骨及软骨定向分化，因此可作为良好的种子细胞。补骨脂素是一种植物类雌激素，因其对成骨细胞、癌细胞、平滑肌细胞、骨髓间充质干细胞均有影响而被越来越多的学者关注[24-25]。
实验用补骨脂素诱导兔骨内膜间充质干细胞，发现10-6mol/L补骨脂素组骨内膜间充质干细胞增殖的吸光度值最高，说明10-6mol/L补骨脂素有最大的诱导细胞增殖的作用。骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白家族中有明确诱导成骨作用的因子[26-27]，实验选用骨形态发生蛋白2作为阳性对照物进一步说明了补骨脂素对细胞的促进分化作用。实验发现补骨脂素组与骨形态发生蛋白2组细胞吸光度值差异无显著性意义，说明10-6mol/L补骨脂素具有和骨形态发生蛋白2同等效力的促进骨内膜间充质干细胞增殖的生物学效应。
应用补骨脂素、兔骨内膜间充质干细胞和聚己内酯三维支架构建人工复合骨，并通过动物实验证实其可治愈骨不连。补骨脂素对骨膜细胞的作用机制可能与植物类雌激素类似，其作用机制可能和细胞表面雌激素受体及MAPK通路相关[28-29]，但其详细机制尚需要进一步的研究。
