摘要:文中建立了在线固相萃取/液相色谱—三重串联四极杆质谱(on-lineSPE/LC-MS/MS)方法同时测定血液和尿液中10种巴比妥类药物。样品用乙腈沉淀蛋白，经在线固相萃取柱(HLB)富集纯化，以Poroshell120EC-C18柱(2.1mm×50mm，1.9μm)为分析柱，乙腈—水为流动相进行梯度洗脱。电离模式为电喷雾电离负模式(ESI-)，扫描方式为多反应监控模式(MRM)，定量方法采用外标法。结果表明，10种化合物在各自质量浓度范围内线性关系良好(权重因子1/x)，相关系数为0.9988～0.9995，方法检出限(MDL)和定量限(LOQ)分别为10.0～20.0ng/mL和20.0～50.0ng/mL，回收率为95.8%～109.5%，相对标准偏差(RSD)为0.5%～3.8%(n=6)。检测方法操作简单，耗时短，检测灵敏度高且结果准确，能够满足血液和尿液样品中10种化合物同时快速筛查和准确定量。
关键词:在线固相萃取;液相色谱—串联质谱;巴比妥类;生物样品
0引言
巴比妥类药物是一类作用于中枢神经系统的镇定剂，在临床上的应用范围广泛，除镇静麻醉作用以外，还可以用作抗焦虑药、安眠药、抗痉挛药。此类药物具有成瘾性，而且，由于其应用广泛，较易获得，易被不法分子用于犯罪，导致自杀、他杀、过量服用中毒等刑事案件的发生。目前有关检测生物样品中巴比妥类药物的文献较少，因此，急需建立测定生物样品中巴比妥类药物的方法，为临床救治和法医毒物分析提供技术支持。
目前测定生物样品中巴比妥类药物的方法有气相色谱法(GC)[1]、气相色谱—质谱联用法(GC-MS)[2-3]、气相色谱—串联质谱法(GC-MS/MS)[4-5]、液相色谱—飞行时间质谱法[6]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[6-9]等。气相色谱法专属性较差，难以满足毒物分析特异性强、定性准确的要求。气相色谱—质谱联用法检测巴比妥类药物灵敏度低，常需要衍生化，前处理过程繁琐而且耗时。液相色谱—质谱联用技术因具有灵敏度高、分析范围广和分析时间短等特点，近年来在毒物分析领域中有着广泛的应用。
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目前，生物样品的前处理方法有液液萃取法(LLC)[1，7-9]、液相微萃取法(LPMC)[3]、固相微萃取法(SPMC)[2]、离线固相萃取法(SPE)[4-6]，等。液液萃取法、液相微萃取法、固相微萃取法和离线固相萃取法作为前处理方法，其操作繁琐，耗时较长，而且成本高。在线固相萃取，其操作自动化程度高、样品用量少、速度快、重复性好，且在线SPE柱可重复使用，而且成本低，是一种经济实惠且绿色环保的前处理手段。作者所在课题组前期已使用在线固相萃取作为前处理方法开发了一系列药物分析方法[10-13]。本文在前期的实验基础上建立了在线固相萃取/液相色谱—三重四级杆串联质谱法(on-lineSPE/LCMS/MS)，以同时快速检测血液和尿液中10种巴比妥类药物。该方法样品前处理自动化程度高、操作简单、分析快速、检测灵敏度高、结果准确，可满足血液和尿液痕量巴比妥类药物的筛查要求。
1实验材料与方法
1.1仪器与试剂
1260液相色谱分离系统(美国安捷伦科技公司)，包括1260InfinityBin二元高压泵(G1312B)、1260InfinityHip脱气机(G4275A)和1290InfinityTCC柱温箱(G1316C)。
1260在线固相萃取系统(on-lineSPE)(美国安捷伦科技公司)，包括1260Infinity自动进样器(G7167A)、1260Infinity四元泵(G1311B)，内置脱气机(G1311-64065)。
6470三重四极杆质谱联用仪(MS/MS)(美国安捷伦科技公司)，配喷射流电喷雾离子源(AJSESI)、MassHunter工作站软件。
3-18R高速冷冻离心机(美国TOMOS公司);SB3200-HT超声波清洗器(必能信上海有限公司);Master-sUV超纯水发生器(上海和泰仪器有限公司)。
用十通阀将在线固相萃取系统与液相色谱分离系统进行连接，通过阀的切换使样品进行在线富集和分析，具体连接方式见图1。
巴比妥(Barbital，98.9%)、戊巴比妥(Pentobarbitone，99.5%)、异戊巴比妥(Amobarbital，98.6%)、苯巴比妥(Phenobarbital，99.1%)、甲苯巴比妥(Methylphenobarbital，98.9%)、司可巴比妥(Secobarbital，99.8%)、硫喷妥(Pentothal，99.6%)、仲丁巴比妥(Butabarbital，99.5%)、环己巴比妥(Cyclobarbital，99.8%)和布他比妥(Butalbital，99.8%)购自Sigma公司;甲醇、乙腈为质谱纯(美国Fisher公司);甲酸、乙酸铵、氨水为色谱纯(美国Fisher公司);实验用水为超纯水。
准确称取10种巴比妥类药物标准品，用乙腈溶解，定容，配制成1.0mg/mL的单个标准储备液，于-4℃保存。使用时根据所需浓度，用乙腈稀释配制成不同质量浓度的单个标准工作液和混合标准工作液。
空白血液和尿液均来自身体健康的志愿者。
1.2在线固相萃取和液相色谱条件
在线SPE条件:SPE柱为WatersOasis?HLB(20mm×3.9mm，5μm);流动相A为水;流动相B为甲醇;流动相C为乙腈。
液相色谱条件:分析柱为安捷伦Poroshell120EC-C18(2.1mm×50mm，1.9μm);流动相A为水;流动相B为乙腈;柱温40℃;进样量50μL;液相梯度洗脱条件及十通阀切换时间见表1。
1.3MS-MS质谱参数
离子化模式为负模式(ESI-);扫描类型为多反应监测(MRM);鞘气温度250℃;鞘气流量12mL/min;雾化器压力35psi;毛细管电压3500V(正极)，2500V(负极);喷嘴电压500V;干燥气流量6mL/min;干燥气温度300℃;MRM总数20;循环时间500ms。
1.4样品处理
分别吸取1.0mL血液和尿液于5mL试管中，加入3.0mL乙腈，涡旋振荡1min，以10000r/min离心10min，吸取1.0mL上清液，加入2.25mL乙酸铵水溶液(0.01mol/L)，涡旋振荡1min，过0.22μm滤膜，供LC-MS分析。
2结果与讨论
2.1质谱条件优化
对10种药物进行一级ESI+、ESI-电离模式考察，结果10种化合物仅在ESI-模式下有响应，均形成[M—H]-离子。利用仪器Optimizer质谱自动优化软件对10种化合物的[M—H]-离子碎裂电压、碎片离子碰撞能量等质谱条件进行自动优化。根据自动优化结果，选取响应强度相对较高的两对离子对分别作为定量离子对和定性离子对。甲苯巴比妥和环己巴比妥的[M—H]-离子只电离得到一个子离子碎片，既是定量离子也是定性离子，优化后的各化合物质谱参数见表2。
2.2流动相的选择
以Poroshell120EC-C18(2.1mm×50mm，1.9μm)作为分析柱，分别对中性—乙腈—水、中性—乙腈-0.01mol/L乙酸铵水溶液、酸性—乙腈—水(含0.1%甲酸)、酸性—乙腈-0.01mol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)、中性—甲醇—水、酸性—甲醇—水(含0.1%甲酸)、中性—甲醇-0.01mol/L乙酸铵水溶液和酸性—甲醇-0.01mol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)等8种体系流动相(分别为图2中的a，b，c，d，e，f，g和h)进行了考察，得到这8种流动相下的响应值，结果表明，当流动相有甲酸和乙酸铵时，两者均产生离子抑制作用，化合物的响应降低;以中性—乙腈—水和中性—甲醇—水作为流动相时，10种化合物的响应更好。两者相比较，中性—乙腈—水作为流动相时，10种化合物的分离效果和峰形更好。因此，实验选择中性乙腈—水为流动相，10种化合物的多反应监控(MRM)色谱图见图3。
2.3样品稀释液的酸碱性对萃取效率的影响
本文中的生物样品用乙腈沉淀蛋白后，其基质液中乙腈含量较高，对On-lineSPE的萃取效率和色谱峰形有不利的影响，因此需要对基质液进行稀释。本研究考察了酸性(0.01mol、L含0.1%甲酸的乙酸铵溶液，pH4.8)、中性(0.01mol/L乙酸铵溶液，pH7.0)和碱性(氨水-0.01mol/L乙酸铵溶液，pH9.2)3种缓冲稀释液对SPE柱萃取效果的影响。结果表明，SPE柱在酸性和中性条件下均能萃取到10种化合物，两者相比较，中性条件下萃取效果最好，10种化合物的分离效果也最好，峰形好且灵敏度高;碱性条件下萃取效果和分离效果均较差。因此，选取0.01mol/L乙酸铵水溶液(pH7.0)为样品的稀释液。
2.4方法的线性范围、检出限、定量限、回收率及精密度
用空白血液和尿液，逐级添加混合标准工作溶液，得到0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0、1000.0ng/mL系列浓度，按“1.4”节样品处理方法进行处理，每个质量浓度重复测定6次以确定方法的精密度。以10种化合物的质量浓度x(ng/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标建立标准工作曲线(权重因子1/x)，以回收率为80%～120%、相对标准偏差(RSD)≤15%(n=6)的加标浓度作为定量限(LOQ)，以定性离子对信噪比(S/N)≥3的加标浓度作为方法的检出限(MDL)。10种化合物在各相对应质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9988～0.9995，方法检出限(MDL)和定量限(LOQ)分别为10.0～20.0ng/mL和20.0～50.0ng/mL，结果见表3;定量限以上、线性范围内添加水平的回收率为95.8%～109.5%，相对标准偏差(RSD)为0.5%～3.8%(n=6)，结果见表4。
3、结语本
研究建立了在线固相萃取作为前处理技术、结合液相色谱—三重串联四极杆质谱同时快速测定血液和尿液中10种巴比妥类药物的方法。样品经乙腈沉淀蛋白和在线SPE柱富集纯化后进行三重串联四极杆质谱检测分析。该方法操作简便省时、灵敏度高、结果准确、重现性好。在线SPE作为前处理方法，其自动化程度高，操作简单，大大缩短了前处理时间，减小了基质干扰，提高了检测分析的质量，为临床救治和法医毒物分析提供了有效的技术手段。
