[摘 要]目的: 建立一种快速、准确的超高效液相色谱串联质谱法( UPLC-MS /MS) ，用于临床上测定人血清中氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齐拉西酮 5 种常用的非典型抗精神病药物的血药浓度。方法: 以氯氮平-d3、喹硫平-d8、阿立哌唑-d8 和齐拉西酮-d8 稳定同位素为内标，血清样品经过前处理后采用 UPLCMS /MS 对上清液进行分析。结果: 空白血清对药物的检测无干扰，氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齐拉西酮在 1. 00 ～ 1 000 μg /L 范围内线性良好，相关系数 r > 0. 998 8; 日内、日间精密度( RSD) 均小于 15% ，回收率 90% ～ 110% ; 样品在室温 12 h、4 ℃冰箱 48 h、自动进样器 24 h 及反复冻融 3 次的情况下都能保持稳定。结论: 本方法前处理操作简单，能够快速、准确、高通量地检测所选择的 5 种非典型抗精神病药物的血药浓度。
[关键词]超高效液相串联质谱; 血药浓度; 非典型抗精神病药物; 血清; 同位素内标
治 疗 药 物 监 测 ( therapeutic drug monitoring， TDM) 是运用现代分析技术，测定血液或其他体液中的药物及其代谢物的浓度，并根据药动学和药效学理论分析并制定最佳给药方案，从而达到安全合理用药的目的[1 - 4]。精神分裂症是一种病因复杂，与中枢神经系统病变有关的疾病，长期应用抗精神病类药物治疗可能产生严重的锥体外系症状 ( EPSs) ，目前非典型抗精神病药已经成为主要的抗精神病药物[5 - 9]。因此，对于抗精神病类药物而言，测定血浆或血清中药物浓度实现个体化给药，能够获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低中毒的风险[10]，为达到这一目的，本研究参考文献[11 - 14]，采用超高效液相串联质谱法( UPLC -MS /MS) 同时检测 5 种非典型抗精神病类药物的血药浓度，报告如下。
1 材料与方法
1. 1 仪器
Waters Acquity UPLC-TQ-D 型液质联用仪( 美国，Waters 公司) ，H1650R 台式高速冷冻离心机 ( 中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司) ，BT125D 电子天平( 德国，赛多利斯股份公司) ，G560E 涡旋混合器( 美国，Scientific Industries 公司) 。
1. 2 试药
氯氮平购自 Sigma( 美国) ，阿立哌唑购自中国食品药品检定研究院，喹硫平、齐拉西酮、氯氮平- d3、喹硫平-d8 和齐拉西酮-d8 购自 Toronto research chemicals Inc( 加拿大) ，N-去甲基氯氮平、阿立哌唑-d8 购自 cerilliant( 美国) ，色谱甲醇、乙腈购自默克公司( 德国) ，屈臣氏蒸馏水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。
1. 3 色谱及质谱条件
1. 3. 1 色谱条件 色谱柱 Acquity UPLC BEH C18 IVD ( 2. 1 mm ×50 mm，1. 7 μm) ，柱温50 ℃，进样量 5 μL，流速 0. 5 mL /min。流动相: 0. 1% 甲酸水溶液 ( A) ，0. 1% 甲酸甲醇溶液 ( B) ，梯度洗脱，0 ～ 0. 5 min 使用 20% B，0. 5 ～ 1. 3 min 使用 20% ～ 80% B，1. 3 ～ 1. 7 min 使用 80% ～ 95% B，1. 7 ～ 1. 75 min 使用 95% ～ 20% B; 1. 75 ～ 2. 0 min 使用 20% B。 +
1. 3. 2 质谱条件 电喷雾离子源，正离子模式; 毛细管电压 3. 0 kV，脱溶剂气温度( TEM) 500 ℃，脱溶剂气流( L /Hr) 800，锥孔气流( L /Hr) 50，扫描模式为多反应监测( MRM) 。常见非典型抗精神病药物质谱参数见表 1。
1. 4 样品处理及标准液的配制
1. 4. 1 样品处理 取血清样品 100 μL 置 1. 5 mL EP 管中，加入 400 μL 内标溶液，涡旋混合 3 min，于 4 ℃ 11 000 r/min 离心 15 min; 取 300 μL 上清液置于另一个 1. 5 mL EP 中，4 ℃ 11 000 r/min 离心 15 min，取 100 μL 上清液置于 96 孔板中，进样 5 μL进行分析。
1. 4. 2 标准溶液的配制 精密称取各标准品 10 mg分别置于 10 mL 量瓶中，用纯甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为 1. 0 g /L 的标准溶液储备液。将各标准溶液储备液用甲醇稀释 10 倍得到浓度为 100 mg /L 的各标准溶液工作液，分别吸取各标准溶液工作液 100 μL 置 1. 5 mL 的 EP 管中，涡旋混匀，得到浓度为 10 mg /L 的混合标准溶液; 用空白血清稀释成浓度分别为 1 000、500、250、100、 50、25、10、5、2. 5 及 1 μg /L 的基质标准曲线。内标的配制: 将浓度为 100 mg /L 的内标溶液储备液用甲醇稀释成浓度为 25 μg /L 的内标工作液，保存于 - 80 ℃冰箱。
1. 5 统计学方法
数据处理采用 MassLynx V4. 2 软件，数据分析采用 Excel 软件计算均值( x) 、标准偏差( S) 和相对标准偏差( RSD% ) ，数据结果采用( x ± s) 表示，日内、日间精密度用 RSD% 进行评价。
2 结果
2. 1 线性和定量下限考察
按照 1. 4. 2 项下步骤配制基质标准曲线及1. 4. 1 项下操作对基质标准曲线进行处理，以各药物的浓度为横坐标，以各药物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标进行线性回归，计算回归方程; 同时，用空白血清配制浓度为 1. 0 μg /L 的各药物的定量下限样品。结果表明，各药物在线性范围内线性良好，各药物的线性范围和线性方程及相关系数见表 2; 各药物在定量下限 1. 0 μg /L 处的响应良好( 见图 1) ，精密度小于 15% ( 见表 3) 。
2. 2 日内、日间精密度和回收率
用空白血清制备低、中、高浓度的质控样品，每个浓度质控样品取 6 份测定作为日内精密度，连续检测 3 天获得的结果作为日间精密度。向空白血清中加入低、中、高浓度的标准品，每个浓度各取 6 份，通过计算检测值与加入的标准品的比值，取平均值得到回收率。结果表明，各药物的日内、日间精密度( RSD% ) 均 小于 15% ; 平均回收率在 90% ～ 110% 。见表 4。
2. 3 稳定性
用空白血清制备低、高浓度的质控样品，每个浓度各取 6 份，考察各药物低、高两个浓度在室温、 4 ℃冰箱、自动进样器以及 3 次反复冻融时的稳定性。室温考察的时间点包括 0、8 及 12 h，4 ℃ 冰箱考察的时间点包括 0、12、24 及 48 h，自动进样器考察的时间点包括 0 及 24 h。结果表明，各药物在考察的条件下均保持稳定。见表 5。
3 讨论
精神疾病是近年来多发的病因不明的疾病之一，精神疾病患者给家庭带来很大的经济压力和心理压力，已经越来越受到医护人员和相关人员的极大关注。传统治疗药物监测技术，例如基于光谱学、免疫抗体学等临床检测技术，具有定性定量特征信息单一的弱点，抗干扰能力差; 目前国内对抗精神类药物进行的血药浓度监测主要运用反相高效液相色谱法[15 - 17]，在灵敏度、特异性和准确性方面与液质联用( LC-MS /MS) 法存在较大差距，且前处理过程复杂、分析时间过长[18 - 20]。LC-MS /MS 具有更高的灵敏度和特异性，并且可以实现多组分同时分析，具有更高的检测通量，在临床检测中表现出较大的优势[21]。本文建立 LC-MS /MS 方法中各药物在 1. 0 ～ 100 0 μg /L 范围内线性良好，相关系数( r) 均大于 0. 998 8; 各药物在定量下限 1. 0 μg / L 处的响应良好，精密度小于 15% ; 日内、日间精密度均小于 15% ; 平均回收率在 90% ～ 110% ，样品稳定性良好。杨春霞[17]等的研究中前处理步骤采用乙醚萃取，再将乙醚真空挥干后复溶，操作复杂，本研究前处理过程仅需甲醇蛋白沉淀一个步骤，大大简化了前处理过程; Dongeun Park 等[11]的研究中液相分离时间为 11 min，本研究中将时间缩短到 2 min，大大缩短检测时间; 同时本研究使用稳定同位素内标，确保检测结果的准确性。因此，与国内外已有的方法相比本研究的方法在前处理过程，检测时间和准确性等方面都有明显优势
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