摘要:目的:研究纤维素酶提取地桃花多糖的最佳条件，并探讨其体外抗氧化活性。方法:以地桃花多糖得率为响应值，在单因素试验基础上，以液料比、酶解温度、酶解时间、酶添加量为试验因素，采用响应面法建立数学模型，筛选最佳提取工艺条件;并使用DPPH和·OH自由基清除能力体系检测地桃花多糖的抗氧化活性。结果:纤维素酶酶解提取地桃花多糖最佳条件为:酶添加量10.8mg/mL、酶解时间72min、液料比7∶1mL/g、酶解温度43℃、pH为5.0，在此条件下地桃花多糖得率为13.32%，与理论值13.37%相对误差小于5%。地桃花多糖具有较强的抗氧活性，对DPPH和·OH自由基清除的半数抑制浓度IC50分别为1.082、3.202mg/mL，但与维生素C比较，抗氧化活性较弱。结论:通过响应面法获得地桃花多糖纤维素酶酶法提取的最佳条件，该工艺条件方便可行，提取到的多糖具有较强的自由基清除能力。
关键词:地桃花，多糖，酶法，提取，响应面法，抗氧化活性
天然植物多糖具有抗炎、抗氧化[1]、增强免疫[2]、抗病毒[3]、防衰老[4]等多种药理作用，且毒副作用低，越来越受到学者的重视[5]。植物多糖可作为食品和药品的有效添加成分，药食两用植物多糖系列产品的市场前景将非常广阔[6]。天然产物多糖来自于植物细胞膜和微生物细胞壁的天然高分子化合物，可采用有机溶剂、酶解等方法提取，其中酶解提取操作简单、条件较温和，在多糖结构研究以及活性保持方面具有一定的优势[7]。
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地桃花(UrenalobataL.)又称肖梵天花、假桃花、野棉花等，属于锦葵科植物，主要产于广西、四川及贵州等地，富含多种药效成分如多糖类、黄酮类、苷类、香豆素、木脂素以及蛋白质[8-10]。研究报道地桃花提取物具有明显的抗炎、抗菌及抗氧化等药理活性[11-13]。地桃花可清热解毒、祛风利湿及活血消肿，用于治疗感冒、痢疾等疾病，是中成药花红片生产的原料成分之一[14]，对其有效成分多糖的研发将有助于提升其药食两用价值。目前有关地桃花单一成分提取及其生物活性的研究报道很少，针对多糖成分，仅见蓝峻峰等采用超声波辅助半仿生法提取，结果表明，在液料比30∶1、超声功率60W、提取温度75℃、提取时间50min的条件下，地桃花多糖得率为12.86%[14]，此工艺相比酶法具有提取温度高、需要超声设备、工艺复杂等缺点。为了解地桃花多糖生物活性及优化其提取工艺，本文研究了纤维素酶提取地桃花多糖的最佳条件，并探讨其体外抗氧化活性，为地桃花多糖进一步开发及抗氧化活性的深入研究提供一定的科技支持。
1材料与方法
1.1材料与仪器
地桃花采自广西容县，经陈晓白教授鉴定为锦葵科梵天花属地桃花干燥全草;纤维素酶(食品级，5万U/g)、维生素C、D-无水葡萄糖购自北京索莱宝科技有限公司;DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)购自日本TCI公司;其它试剂均为国产分析纯。
5810R型高速离心机德国Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度计上海谱元仪器;SHA-BA双功能水浴恒温振荡器常州华普达教学仪器;PHS-25型pH计上海雷磁;SHB-III型循环水真空泵、2L-ARE旋转蒸发器上海皓庄仪器。
1.2实验方法
1.2.1地桃花多糖的提取地桃花全草自然晾干，精确称取5.0g粉碎并过100目筛后的地桃花粉，按设定酶解条件(pH、液料比、酶添加量、酶解时间、酶解温度)，在180r/min摇床上进行酶解提取实验，得到多糖浸提液。多糖浸提液经90℃高温灭活、6000r/min离心分离10min、抽滤、滤液用旋转蒸发仪80℃浓缩至1/10、乙醇沉淀、Sevag法除蛋白、透析除杂、乙醇二次沉淀、真空冷冻干燥(温度-55℃，压力0.05MPa)一系列步骤[15]，最终获得地桃花多糖。
1.2.2地桃花多糖含量的测定多糖测定采用苯酚-硫酸法[16]，葡萄糖标准曲线方程为y=8.4986x-0.0185，R2=0.9903，式中y为490nm条件下的吸光度值，x为葡萄糖质量浓度(mg/mL)。多糖得率计算公式如下:
1.2.3单因素实验酶解时摇床转速固定为180r/min，分别考察pH(3.0、4.0、5.0、6.0)、液料比(4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1mL/g)、酶添加量(2、6、10、14、18mg/mL)、酶解时间(40、80、120、160、200min)和酶解温度(35、45、55、65℃)对地桃花多糖得率的影响，其中各因素固定水平为pH5.0、液料比8∶1mL/g、酶添加量10mg/mL、酶解时间80min、酶解温度45℃。
1.2.4响应面试验响应面因素水平设计见表1，自变量包括液料比、酶解时间、酶添加量、酶解温度四个因素，以多糖得率为响应值。响应面试验因素及水平表如表1所示。
1.2.5地桃花多糖体外抗氧化活性测定
1.2.5.1DPPH自由基清除能力测定取不同质量浓度的地桃花多糖溶液2mL和2mLDPPH溶液(0.2mmol/L)混匀，反应30min后在517nm处测定其吸光度A1，同法测定2.0mL乙醇加样液的吸光度A2，以及2.0mLDPPH溶液与2.0mL蒸馏水的吸光度A0，以维生素C作为对照，样品对DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100[15]。
1.2.5.2·OH的清除能力测定取不同质量浓度的地桃花多糖溶液2mL，依次加入浓度均为5mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2mL，混匀，静置10min，再加入5mmol/L的水杨酸溶液2mL，混匀，37℃水浴30min后，波长510nm处测定吸光度B1，用蒸馏水代替水杨酸测定吸光度B2，以蒸馏水代替样品溶液测定吸光度B0，以维生素C作为对照，样品对·OH的清除率Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100[15-16]。
1.3数据处理
所用数据是3次平行实验的均值±标准差，响应面数据分析采用DesignExpert8.06软件，采用SPSS20.0进行数据间的显著性分析，并利用GraphPadPrism6.0软件进行绘图。
2结果与分析
2.1单因素实验
2.1.1纤维素酶添加量对地桃花多糖得率的影响由图1可知，当酶添加量从2mg/mL增加到10mg/mL时，多糖得率显著提高(p<0.05)，由8.19%上升至12.78%，进一步加大酶用量，多糖得率没有显著变化(p>0.05)，说明在该底物浓度下，酶浓度已经趋于饱和，继续增加纤维素酶用量，对多糖得率没有显著影响(p>0.05)。因此，选择10mg/mL作为纤维素酶的最佳添加量。
2.1.2pH对地桃花多糖得率的影响由图2可知，当pH由3.0增加到5.0时，多糖得率由8.65%增加至最大值12.46%(p<0.05)，pH增大到6.0时，多糖得率反而减小，得率为11.98%，与pH4.0、pH5.0比较差异均不显著(p>0.05)。因为在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适于与底物结合，pH高于或低于最适pH时，活性基团的解离状态可能发生改变，酶和底物结合力减弱，酶反应速率降低。因此，酶解最适pH选定为5.0。
2.1.3液料比对地桃花多糖得率的影响由图3可知，当液料比由4∶1增加到8∶1时，多糖得率由9.45%增加至13.25%(p<0.05)，之后，随着液料比继续增大，多糖得率反而减小，原因可能与过高液料比不利于多糖物质溶出有关，此外，水用量过大加重后续浓缩工作负担，不利于工业化实际生产。故液料比选择为8∶1mL/g。
2.1.4酶解温度对地桃花多糖得率的影响由图4可知，温度由35℃上升到45℃，多糖得率由9.35%增大至13.28%，主要因为温度升高增强酶活性，促进有效成分溶出，55℃时多糖得率为13.07%，与45℃比较变化不显著(p>0.05)，进一步提高温度至65℃，此时多糖得率显著减小(p<0.05)，这是因为温度过高导致酶活力减弱所致。因此选择45℃为最适酶解温度。
2.1.5酶解时间对地桃花多糖得率的影响由图5可知，酶解40min时多糖得率为8.65%，当时间延长至80min时，多糖得率接近160min时的最大值，再继续延长提取时间，多糖得率变化不显著(p>0.05)，多糖提取效率反而降低，此外，酶解时间过长，酶催化活性减弱反而对多糖提取不利，考虑实际生产效率。因此，本研究选择80min为最佳酶解时间。
2.3地桃花多糖的体外抗氧化活性
2.3.1地桃花多糖对DPPH自由基的清除作用由图7可知，当地桃花多糖浓度在0.2～10mg/mL时，对DPPH自由基清除率不断增大，当质量浓度为10mg/mL时，地桃花多糖对DPPH自由基清除率为90.06%，而维生素C对DPPH自由基清除率可达94.12%，地桃花多糖清除DPPH自由基的半数抑制浓度IC50为1.082mg/mL，维生素C的IC50为0.643mg/mL，两者比较，地桃花多糖清除能力较弱于维生素C。以上结果提示地桃花多糖具有较好的DPPH自由基清除作用。
2.3.2地桃花多糖对·OH清除作用由图8可知，当地桃花多糖浓度在0.2～10mg/mL时，对·OH清除率稳步提升，而维生素C在浓度4mg/mL时对·OH清除率就已达到最大值，之后趋于稳定。当质量浓度为10mg/mL时，地桃花多糖对·OH清除率为89.75%，维生素C对·OH清除率可达96.38%，地桃花多糖清除·OH的IC50为3.202mg/mL，维生素C的IC50为0.368mg/mL，两者比较，维生素C清除能力强于地桃花多糖。以上结果说明，地桃花多糖具有较好的·OH清除作用。
3讨论与结论
本研究在单因素实验基础上，通过响应面优化试验考察了地桃花多糖纤维素酶提取的工艺。结果发现，纤维素酶添加量对地桃花多糖得率影响最大，其次是酶解时间和液料比，而酶解温度对其多糖提取影响最小;地桃花多糖最佳酶解提取条件为酶添加量10.8mg/mL、酶解时间72min、液料比7∶1mL/g、酶解温度43℃、pH=5.0，在此条件下地桃花多糖的得率为13.32%，与回归模型方程预测值13.37%相比，相对误差小于5%。蓝峻峰等[14]探讨超声波法辅助半仿生法提取地桃花中多糖的最佳工艺，采用半仿生提取，在超声波协同作用的基础上，以正交试验法考察超声功率、超声时间、超声温度等因素对多糖得率的影响，结果获得地桃花多糖得率为12.86%，稍小于本研究中的多糖得率，本研究酶法提取温度43℃明显低于其提取温度75℃，节约能源，且不需要大型设备，液料比明显减小，可一定程度上提高生产效率。
体外抗氧化活性试验表明，地桃花多糖对DPPH自由基、·OH均具有较强的清除能力，在本实验质量浓度下，其对两种自由基的清除能力均呈现一定的正相关关系。地桃花多糖清除DPPH自由基的IC50为1.082mg/mL，清除·OH的IC50为3.202mg/mL。但与维生素C比较，地桃花多糖清除两种自由基的能力较弱。薛井中等也研究地桃花水提取物清除·OH和DPPH自由基、及抑制油脂氧化的能力，结果表明地桃花提取物各部位均有一定的抗氧化能力，但抗氧化活性都弱于维生素C[17]，与本研究结果一致。以上结果为地桃花功能成分的研究开发提供一定的前期理论基础。
