摘要:本文分别采用乳酸菌与酵母菌发酵提取仙人掌多糖，并探究仙人掌多糖的抗炎功效。在三个单因素液料比、时间、pH方面探究仙人掌多糖的提取工艺，得到三因素最适组合，乳酸菌发酵最适提取工艺为发酵时间7h、液料比25∶1(mL/g)、pH为5，此工艺下多糖得率为0.26%。黄酒酵母发酵最适提取工艺为发酵时间48h、液料比25∶1(mL/g)、pH为3，此工艺下多糖得率为0.53%。应用实时荧光定量PCR法检测仙人掌多糖对IL-6、IL-8炎症细胞因子相关基因表达的影响，得知仙人掌多糖通过抑制IL-8的表达，促进IL-6的表达来抑制炎症的发生和发展。
关键词:仙人掌多糖，微生物提取技术，乳酸菌，酵母菌，抗炎
仙人掌(OpuntiadilleniiHaw)属仙人掌科仙人掌属植物，是热带及亚热带植物，多生长于美洲及墨西哥干旱荒漠或者是半荒漠地区，其中以墨西哥分布最多。我国主要分布在广西、江西、广东、福建、海南等地。仙人掌用途广泛，如食用、做观赏植物、药用等。赵学敏所著的《本草纲目拾遗》中记载，仙人掌可作为药用植物，其具有清热解毒、安神利尿、行气活血、消肿止痛、健脾止泻的功效，可内服，亦可外用治疗疾病。
仙人掌内丰富的仙人掌多糖(Opuntiadilleniipolysaccharide，ODP)是其有诸多功效的主要原因之一。ODP主要从仙人掌的果实和茎里提取而来，极性大分子化合物葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖是其主要组成物质。目前，ODP的抗氧化、抗炎抑菌、免疫、降血糖血脂、抗肿瘤、护肝[1-10]等多种功效都已被证实。除上述的药理功能，ODP还可防脱发[11]，治疗神经退行性疾病药物[12]，促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能[13]。如今，仙人掌应用愈加广泛，如:市面上已有仙人掌制的果蔬汁、保健品和面粉制品出售。
传统的提取多糖的方法如包含水提、碱提、酸提、苯酚提取、微波辅助提取、超声辅助提取和酶提等方法[14]，存在多糖提取率低，纯度不高，原料浪费严重，且影响对多糖进行结构分析和功效鉴定等问题[15]。本实验采用微生物法提取多糖，是利用微生物在生长过程中，会利用其他营养物质进行生长，但并不利用多糖对植物多糖进行去杂纯化，反应条件温和且能耗少。此外，因新鲜仙人掌肥厚的肉质茎含有丰富的蛋白质、矿物质、纤维素和维生素C等，同时含有丰富的SOD、黄酮类及多糖等活性功能成分[16]，所以本实验采用新鲜的仙人掌叶片来进行试验。本文研究将从以下两个方面进行:一是用乳酸菌、酵母菌发酵新鲜仙人掌来探究ODP提取工艺;二是用发酵得到的多糖液做抗炎实验，探究ODP的抗炎活性。
1材料与方法
1.1材料与仪器
新鲜仙人掌生长期为3～8个月，云南白药集团公司;硫酸、苯酚、葡萄糖(均为国产分析纯)北京化工厂;乳酸菌北京川秀科技有限公司;酵母菌中国科学院微生物所;Hacat细胞中国检验检疫科学研究院中德化妆品研究所细胞毒理实验室;水、过滤超纯水实验室制备。
BS2202S型电子天平、A2492型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司;HR2195搅拌机匀浆机飞利浦有限公司;YZB-苏(锡)1132-2004低速大容量离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;DSHZ-300恒温水浴振荡器江苏省太仓市实验设备厂;电热恒温水浴锅北京长安科学仪器厂;WJ-80A-ⅡCO2培养箱上海圣科;细胞培养瓶、板，冻存管美国Corning/Costar;ABI7300型荧光定量PCR仪美国应用生物系统公司;SW-CJ-1D超净工作台上海启前电子科技有限公司;Enduro水平电泳仪美国Labnet公司;Sigma1-14微型离心机德国Sigma;Sigma3-30K高速台式冷冻离心机德国Sigma;GeneAmpPCRSystem9700PCR仪美国ABI应用生物系统公司。
1.2实验方法
1.2.1ODP提取工艺新鲜仙人掌茎洗净、去刺、去皮后切碎，用匀浆机匀浆2min，再进行高压灭菌(120℃，30min)，在超净台将加入4mL菌液加入100mL仙人掌匀浆液中后用封口膜封口，于空气摇床(180r/min)培养，而后离心(20000r/min，10min)取上清，用旋蒸仪将上清液浓缩至原体积的1/3，再以3倍体积95%乙醇醇沉12h，再一次离心(20000r/min，10min)，取沉淀热水(60℃)溶解得粗多糖液。
1.2.2ODP含量测定标准曲线绘制:参照苯酚硫酸法[17]，结果显示在0～120μg/mL浓度范围内，葡萄糖与A490呈良好的线性关系，以吸光度对多糖浓度C进行线性回归，得到回归方程:y=0.0151x+0.0042(R2=0.9996)，y表示吸光度值A490，x表示仙人掌多糖的浓度，μg/mL。
ODP样品含量测定:取两只带塞试管，分别吸取1mL待测液和1mL去离子水，再分别依次添加0.5mL5%苯酚，摇匀后加入2.5mL浓硫酸，盖上试管盖，再充分摇匀，静置5min后，置于水浴锅中沸水浴1h，测定吸光值A490。并根据回归方程计算ODP浓度。
ODP得率(%)=所得的ODP浓度×仙人掌多糖液体积/仙人掌的质量×100
1.2.3乳酸菌发酵法的单因素实验
1.2.3.1时间对多糖得率的影响将提取的液料比固定为20∶1(mL/g)，温度固定为35℃，pH固定为7，选取5个时间梯度5、6、7、8、9h，作为探究乳酸菌发酵提取时间的单因素条件，取一定量的多糖溶液，测定该因素下提取得到的多糖含量，从而计算得到多糖得率。
1.2.3.2液料比对多糖得率的影响将提取时间固定为7h，pH固定为7，温度固定为35℃，选取5个液料比梯度10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)，作为探究乳酸菌发酵提取液料比的单因素条件，取一定量的多糖溶液，测定该因素下提取得到的多糖含量，从而计算得到多糖得率。
1.2.3.3pH对多糖得率的影响将提取的液料比固定为20∶1(mL/g)，温度固定为35℃，时间固定为7h，选取5个pH梯度为3、4、5、6、7，作为探究乳酸菌发酵提取pH的单因素条件，取一定量的多糖溶液，测定该因素下提取得到的多糖含量，从而计算得到多糖得率。
按以上实验所得的最佳单因素条件进行实验，计算最大的仙人掌多糖得率。
1.2.4酵母菌发酵法的单因素实验
1.2.4.1时间对多糖得率的影响将提取的液料比固定为20∶1(mL/g)，发酵温度固定为28℃，pH固定为5.5，选取5个时间梯度24、36、48、60、72h作为探究黄酒酵母发酵提取时间的单因素条件，取一定量的多糖溶液，测定该因素下提取得到的多糖含量，从而计算得到多糖得率。
1.2.4.2液料比对多糖得率的影响将提取时间固定为48h，pH固定为5.5，温度固定为28℃，选取5个液料比梯度10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)，作为探究黄酒酵母发酵提取液料比的单因素条件，取一定量的多糖溶液，测定该因素下提取得到的多糖含量，从而计算得到多糖得率。
1.2.4.3pH对多糖得率的影响将提取的液料比固定为25∶1(mL/g)，温度固定为28℃，时间固定为48h，选取5个pH梯度3、4、5、6、7作为探究黄酒酵母发酵提取pH的单因素条件，取一定量的多糖溶液，测定该因素下提取得到的多糖含量，从而计算得到多糖得率。
1.2.5细胞培养冻存人表皮永生化细胞(Hacat细胞)从-80℃的冰箱中取出后，迅速37℃水浴，轻微震动1～2min使其彻底融化。1000r/min离心10min，弃上清。加1mL细胞培养液(Dulbecco’sModifiedEagle’smedium，DMEM)，转移到10cm2培养瓶中，置于37℃5%CO2环境中培养。细胞生长到90%融合时，动作轻柔地用2mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗两次。加200μL0.25%胰酶后，放入CO2培养箱中消化5min，在观察确认细胞已从培养瓶壁上脱落后，加2mL的完全培养液终止消化，800r/min离心l0min，去上清液，加入4mL培养液，计数后，以5×105密度接种于10cm2培养瓶。
1.2.6MTT法测定Hacat细胞毒性实验选取对数生长期状态良好的Hacat细胞。用0.25%胰蛋白酶将Hacat细胞消化，1500r/min离心1min后重悬于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，计数;用96孔培养板接种细胞，并设置空白对照，边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)填充，在5%CO2，37℃环境中培养12h;按照各自终浓度分别加入ODP，细胞对照组是未做处理的组，每组设3个复孔，培养44h后，加入5g/L的MTT溶液，继续在37℃，5%CO2环境中培养4h后终止培养;吸除孔内液体，用PBS洗涤1次，加入DMSO溶解结晶;M3读板仪测定各孔吸光度值A570。分别用0.5、1、2、2.5、5mg/mLODP处理Hacat细胞。
Hacat细胞存活率(%)=(测定孔吸光度值-空白对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100
1.2.7ODP处理时间对炎症细胞因子IL-6、IL-8基因表达的影响将消化后的细胞(消化方法参照1.2.5)，以2×106/孔的密度接种6孔板内，以0.5mg/mL的ODP处理细胞不同时间(0、0.5、1、1.5、2h)。提取细胞总RNA，荧光定量分析处理对炎症细胞因子在转录水平表达的影响，内参基因定为β-actin。
1.2.8炎症细胞因子IL-6、IL-8基因在转录水平表达量的测定
1.2.8.1细胞总RNA提取与检测总RNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测RNA，参照文献[18-19]。
1.2.8.2cDNA第一链合成使用TINAGENFastQuantRTKit(WithgDNase)FastQuantcDNA第一链合成试剂盒(去基因组)进行cDNA第一条链合成反应。将得到的cDNA中加1000μLddH2O，稀释混匀，-20℃保存。
1.2.8.3引物及探针的设计和合成根据NCBI发布的IL-6、IL-8等基因的序列，用PrimerExpress软件设计特异性引物，同时设计管家基因β-actin的特异性引物。基因引物序列见表1。
1.2.8.4实时荧光定量PCR以cDNA为模板，反应体系为20μL，其中PrimeScriptRTEnzymeMIX10.4μL，ddH2O7.6μL，正向、反向引物各0.5μL，cDNA模板1μL，使用ABI7300荧光定量PCR仪扩增实验样本，扩增条件为95℃2min预变性，然后按95℃15s，57℃20s，72℃30s，做42个循环，在72℃收集荧光信号。
1.3数据处理
实验中每个处理重复三次，用SPSS25.0软件进行数据的显著性分析，应用Origin9.0软件作图。
2结果与分析
2.1乳酸菌发酵提取多糖单因素实验
2.1.1时间对得率的影响按照方法
2.1.2液料比对得率的影响按照方法1.2.3.2探究不同液料比对ODP提取的影响，结果见图2，随着液料比的增加，ODP得率显著性增加(p<0.05)，当液料比为20∶1mL/g增加为25∶1mL/g时，得率不显著增加达到最大值0.23%(p>0.05)，随后得率显著性下降(p<0.05)。这是因为在一定范围内，增加提取液体积可以增加溶剂与提取物质的接触面积，使多糖得以较多溶出，但继续增加提取液体积会使多糖达到饱和[20]。因此，乳酸菌发酵提取的最佳提取液料比为25∶1mL/g。
2.1.3pH对得率的影响按照方法
1.2.3.3探究不同pH对ODP提取的影响，结果见图3，随着pH升高，ODP得率显著增加(p<0.05)，在pH=5时得率达到了最大值0.28%，pH在5～6时得率不显著降低(p>0.05)，超过6之后，得率显著降低(p<0.05)。这是因为乳酸菌适宜在弱酸情况下生长，随着pH的降低，菌体生长受到抑制[21]。因此，选取5作为乳酸菌发酵提取的最佳pH。以温度为35℃，时间为7h，pH为5，液料比为25∶1mL/g为试验条件，提取ODP，所得的ODP得率为0.26%。经过工艺优化的热水浸提法得到的得率最高为0.12%[22]，乳酸菌发酵的ODP得率比热水浸提法的得率高出0.14%。
2.2酵母提取多糖的单因素实验
2.2.1时间对得率的影响按照方法
2.2.2液料比对得率的影响按照方法
1.2.4.2探究不同液料比对ODP提取的影响，结果见图5，随着液料比的增加，ODP得率发生显著性变化，当液料比达到20∶1mL/g，ODP出现降低，当液料比达到25∶1mL/g，得率升高到最大为0.48%，随后得率显著下降(p<0.05)。这是因为在一定范围内，随着液料比的增大，提取液体积变大，提取的损耗增加，在液料比20∶1mL/g时损耗增大量大于提取率的增大量，当提取液体积继续增大时，损耗比提取得率的增加量小，但当达到某一提取液体积时，多糖溶出会达到饱和从而使ODP得率下降。因此，取25∶1mL/g为黄酒酵母发酵提取最佳液料比。
2.2.3pH对得率的影响
按照方法1.2.4.3探究不同pH对ODP提取的影响，结果见图6，在pH=3时ODP得率最高0.53%，随着pH的增加得率显著降低(p<0.05)。黄酒酵母适应偏酸性环境，但不适应强酸。因此，黄酒酵母发酵提取最佳pH为3。
经过工艺优化的热水浸提法得到的得率最高为0.12%[22]，经本实验所得的黄酒酵母发酵的工艺条件为温度28℃，时间48h，液料比25∶1mL/g，pH为3，得率能达到0.53%，比热水浸提法得率到了4倍。
2.3MTT法测定Hacat细胞毒性如图7所示，以未加任何ODP的细胞作空白对照，当ODP浓度高达2mg/mL时，细胞增殖活力依然超过90%，说明ODP对细胞几乎无毒性。且当ODP浓度减小，细胞增殖活力反而增加，ODP浓度为0.5mg/mL时，细胞存活率高达109.07%，说明低浓度ODP对HacaT有增殖作用。
2.4ODP处理时间对炎症细胞因子IL-6、IL-8基因表达的影响
考察时间效应，用ODP处理Hacat细胞，2h内炎症因子类基因(IL-6、IL-8)表达量产生了不同的变化。
促炎症因子IL-6是一种在炎症和免疫反应中具有多种功能细胞因子，可以促进炎症反应中花生四烯酸的释放，刺激T细胞活化和增殖，提高B细胞中免疫球蛋白的生成，并且诱导急性期反应蛋白的产生[23]。ODP添加时间对促炎症因子IL-6表达量的影响如图8所示，可看出15min内基因表达量出现降低，15～30min时间内IL-6表达量平缓升高，而在30～90min时间内，表达量发生了显著的提高(p<0.01)，此后又缓慢下降，在2h的表达量与60min时的表达量差不多，但是显著高于初始值(p>0.05)。整体来看，30min后的促进作用是ODP对IL-6基因表达量的主要影响。ODP对IL-6基因表达量的影响作用，可验证ODP可能是通过促进IL-6基因的表达从而影响花生四烯酸的代谢而起到抗炎作用的。
IL-8在许多炎症反应中具有聚集和激活淋巴细胞、白细胞和血管内皮细胞的功能，可因局部产生的IL-8直接作用于表皮细胞，促进慢性炎症的发展[24]。ODP添加时间对的其表达量的影响如图9所示，IL-8基因的表达量在15min内迅速下降，显著低于初始值(p<0.01)，并在之后的15min内继续缓慢下降，在30～90min这段时间内在保持显著小于初始值的范围内缓慢上升(p<0.05)，而之后到2h之间，其又缓慢下降。整体来看，在0～15min内ODP迅速抑制IL-8的表达，并在2h的时间内ODP始终保持抑制IL-8的表达，这是ODP对IL-8基因作用的主要体现。大量的中性粒细胞因IL-8表达的增高而向炎症区域聚集，从而释放炎症介质加重炎症反应。IL-8的表达因受到ODP作用而受到抑制，间接地炎症的发生和发展就受到抑制。
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3结论
在本课题的研究中，采用乳酸菌与黄酒酵母对用微生物法提取多糖进行了初步探索。结果显示，同样直接使用新鲜的仙人掌汁进行提取，采用乳酸菌发酵最适提取工艺:发酵时间7h、液料比25∶1(mL/g)、pH为5，此工艺下多糖得率为0.26%。黄酒酵母发酵最适提取工艺:发酵时间48h、液料比25∶1(mL/g)、pH为3，此工艺下多糖得率为0.53%，黄酒酵母发酵所得ODP得率远远高于乳酸菌，因此选取黄酒酵母作为发酵菌种提取ODP会更有优势。本课题也探究了ODP抗炎能力，结果显示ODP通过抑制IL-8的表达，促进IL-6的表达来抑制炎症的发生和发展，为研究仙人掌的抗炎效果提供理论依据。
