摘 要：使用A型和B型两种不同的明胶制备止血微球，对比其对兔耳缘静脉和兔肝创面止血的效果。采用水油乳化法制备明胶止血微球，并用低浓度的戊二醛溶液对其交联;通过吸水率、体外全凝血实验、兔耳缘静脉和兔肝创面止血实验对比了两种明胶微球止血效果上的差异。结果表明：B型明胶微球吸水率更高、凝血效果更好、兔耳缘静脉和兔肝创面止血时间更短;两种明胶微球都能促进止血，但B型明胶微球止血效果优于A型明胶微球。
关键词：明胶;微球;止血
1概述
失血是导致伤者在意外事故中死亡的主要原因之一[1]。战争和突发性的自然灾害造成的死亡人群中，有90%以上都与未能及时止血有关[2]。一般成年人总血量为4000mL左右，当失血达到人体总血量的1/3时就会出现休克，当失的血液达到人体总血量的一半时，人体的各个组织或者器官就会严重受损，如果得不到救治很快就会导致死亡。所以止血在突发意外和手术过程中显得尤为的重要。
明胶，胶原水解之后的一类蛋白质，是一种天然的高分子材料。它是有特定的氨基酸序列构成，并且明胶中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的含量很高，在结构上，明胶分子还包含重复的甘氨酸-X-Y结构，其中X、Y为脯氨酸或羟脯氨酸。所以明胶分子中含有大量的羟基羧基和氨基，具有较强的吸水能力，明胶继承了胶原很多的特殊性质，如：可生物吸收性，生物相容性，易加工性，并且明胶分子有许多暴露的活性侧基，化学反应活性很高，这就使得明胶很容易进行化学改性。从1945年Correll和Wise首次将明胶作为止血敷料用于临床手术中以后，明胶作为一种具有止血效果的生物材料，开发出了许多各类形态的止血材料，如：纤维网状、多孔海绵状、薄膜状等。
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本研究采用水油乳化法制备明胶微球，并使用戊二醛作为交联剂改善其热学及化学稳定，通过体外凝血实验、兔耳缘静脉和兔肝创面止血实验研究了两种不同类别的明胶(A型和B型明胶)制备的微球的止血效果。
2材料与方法
2.1试剂及仪器
A型明胶(gelatintapeA)和B型明胶(gelatintypeB)：Sigma进口分装;50%戊二醛、丙酮、异丙醇、span-80和液体石蜡：成都科龙化工试剂厂;电子天平，型号BSA224S：塞多利斯科学仪器有限公司;电动搅拌机：江苏省金坛市鸿科仪器厂。
2.2实验方法
2.2.1明胶微球的制备
采用水油乳化法制备明胶微球。将1g明胶在45℃下溶于10mL去离子水中得到明胶溶液，将明胶溶液滴入45℃的300mL液体石蜡中同时加入9mLspan-80，搅拌15min，搅拌速度1000r/min。随后冰水浴15min使温度降至10℃以下。过滤并用丙酮和异丙醇交替洗涤6次，室温烘干后用10mol/L的戊二醛溶液交联8h，最后再使用丙酮和异丙醇交替洗涤6次得到明胶微球。
2.2.2扫描电镜观察明胶微球形貌
样品表面喷金，使用扫描电镜(日本HITACHIS-4800)观察微球形貌。
2.2.3体外全凝血测定
体外全凝血的测定采用Gu等的方法。将处理好的抗兔凝血液从冰箱中取出，在37℃的水浴中孵浴，待完成后用移液枪取200µL放入洁净的10mL塑料离心管，分别加入称量好的0.1g的试样，不加任何材料的作为空白组，每一份样品设三支离心管。将各管中的血液与样品轻轻摇匀，使得血液都在试管的底部，取20µL氯化钙溶液滴加入离心管中并开始进行凝血计时，分别在时间刻度为60s，120s，240s时计时完毕。之后加入去离子水10mL，待上下振动离心管3次，稳定后吸取上清液100µL于96孔板中。用紫外分光光度计在波长540nm处测其吸光度。
2.2.4兔耳缘静脉止血
取体重为2~2.5kg的新西兰大白兔按照30mg/kg的剂量，采用3%的戊巴比妥钠麻醉剂静脉注射对其麻醉然后固定四肢。使用脱毛剂处理兔子耳背面的毛发，暴露耳静脉。用碘酒和医用消毒酒精对耳朵背部消毒后，将耳缘静脉横切切断，在自由出血3s后，用灭菌纱布轻轻的将耳朵伤口上的浮血擦去，并立刻将明胶微球撒在伤口处，每15s观察一次，直到伤口不再出血为止，记录出血时间。自然止血组不作任何止血处理，同样待不再渗血后记录出血时间。每组实验重复三次。
2.2.5兔肝创面止血
取体重为2-2.5kg的新西兰大白兔按照30mg/kg的剂量，采用3%的戊巴比妥钠麻醉剂静脉注射对其麻醉然后固定四肢。使用脱毛剂处理下兔子腹部的毛发，用碘酒和医用消毒酒精对腹部手术部位消毒后，于兔子的腹中线作一长约5cm纵行切口，暴露肝脏，用刀片在肝脏中叶切1cm×1cm，深0.5cm的十字型伤口，在自由出血3s后，用灭菌纱布将伤口上的浮血轻轻擦去，并立刻将明胶微球撒在伤口处，每15s观察一次，直到伤口不再出血为止，记录出血时间。自然止血组不作任何止血处理，同样待不再渗血后记录出血时间。每组实验重复三次。
2.2.6数据分析
采用SPSSStatistics17.0软件进行ANOVA分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验分析P<0.05为差异有显著性意义，用**代表差异P<0.01。
3结果与讨论
3.1明胶微球形貌
图1A和1B分别是A型和B型明胶微球形貌SEM图，微球球形度好，并且表面光滑无明显团聚现象，且A，B型明胶微球粒径在为10~30μm。
3.2体外全凝血实验
OD值是表示被检测样品溶液吸光度的物理量，吸光度越低代表上清液中残留的血细胞越少，说明样品的凝血性能更好。如图2所示，在第1、2和4min时，两种明胶微球的凝血性能都优于空白对照组，且B型明胶微球的凝血性能优于A型明胶微球，这说明明胶微球有利于促进血液的凝固从而达到快速止血。
3.3耳缘静脉止血
如图3A所示是两种微球耳缘静脉止血时间，A型和B型明胶微球的止血时间分别为64s和55s，且显著低于空白组的止血时间，表明两种明胶微球对兔耳缘静脉出血有明显的止血效果。由于B型明胶微球的吸水率更高和带有更多的负电荷，B型明胶微球的止血时间要高于A型明胶微球，这表明止血时间与吸水率和表面负点电荷的多少呈正相关关系。这可能是由于微球表面的负电荷能诱导凝血FXⅡ因子的激活和促进它激活。图3B是使用B型明胶微球止血完毕后的照片，止血完成后，未见微球被血液浸湿，说明微球有良好的止血效果。
3.4兔肝创面止血
如图4A所示是两种微球兔肝脏创面止血时间，A型和B型明胶微球的止血时间分别为125s和114s，且显著低于空白组的止血时间，表明两种明胶微球对兔肝脏创面出血有明显的止血效果。这与上述兔耳缘静脉止血实验结果相符。图4B是B型明胶微球止血后的效果图，可以看到，止血完毕后微球紧紧黏在肝脏表面并形成了类似糊状的基质，由此封堵住伤口，达到止血。且伤口表明微球未被血液浸湿，表明微球有良好的止血效果。
4结束语
明胶在人体温环境下就会溶解，所以适当交联以提高其化学和热学稳定，使之能应用于人体温环境。制得的明胶微球粒径为10~30μm，表面光滑，成球性良好。从体外凝血和体内止血效果上看，B型明胶明胶微球都优于A型明胶微球，其主要的原因是由于B型明胶微球有较高的吸水率，使得B型明胶微球能更快吸收血液中的水分凝聚血小板和红细胞并形成物理性封堵，从而提高其止血效果。
