摘要:为了解聚乙烯亚胺(PEI)基因载体材料对生物体的细胞毒性机理，采用动态光散射、紫外—可见光吸收光谱、荧光光谱和圆二色谱研究PEI(分子量为25kDa)对二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体与溶菌酶相互作用的影响。实验发现:PEI对溶菌酶的构象影响不明显，但是PEI与DOPS的静电结合能引起脂质体膜结构的变化并对脂质体与溶菌酶的相互作用产生影响。在水溶液中，溶菌酶与DOPS脂质体结合，部分嵌入脂质体双分子层的疏水区，导致溶菌酶α-螺旋结构的减少，PEI与DOPS脂质体的结合增强了脂质体膜内疏水性及其与溶菌酶的相互作用。
关键词:聚乙烯亚胺;磷脂酰丝氨酸;脂质体;相互作用
基因治疗是当前生物医学领域的前沿研究，为恶性肿瘤、神经系统疾病及遗传疾病的治疗提供了新方法，该技术的关键是需要建立高效低毒的基因载体。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)作为典型的阳离子聚合物，由于其高电荷密度和强大的“质子海绵效应”而拥有良好的基因转染效率，分子量为25kDa的支链PEI(bPEI25k)被认为是聚合物基因载体的“黄金标准”[1]。PEI具有不同程度的细胞毒性，但是目前人们对其细胞毒性机理的了解还相当有限[2-3]。研究发现，PEI的毒性与其对细胞膜的扰动有关[4-7]。细胞膜主要由脂类、蛋白质、糖类等组成，而蛋白质与物质传递、能量转换及细胞识别等功能密切相关。生物体内广泛存在生物膜与蛋白质的相互作用，蛋白质与生物膜中的磷脂以疏水和静电相互作用，不仅改变自身的空间构象如去折叠或造成蛋白质聚集等，而且还改变磷脂膜的分布与排列进而影响生物膜的功能与结构[8-9]。
溶菌酶(Lysozyme，Lys)在体内广泛存在，通过水解肽聚糖的糖苷键破坏各种致密的微生物膜结构，具有很强的抗菌消炎作用[10]。Lys的抗菌作用与Lys和细菌膜脂质相互作用有关，研究发现Lys能分别渗透到大肠杆菌的外膜和内膜，同时能使细胞质膜去极化而引起细胞质渗漏[11]。Tsunoda等[12]、Kinnunen等[13]和Gorbenko等[14]认为Lys以静电作用吸附在负电磷脂膜如磷脂酰甘油(phatidylglycerol，PG)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)磷脂膜表面，并通过疏水作用部分插入磷脂膜双分子层，从而使磷脂膜的结构和Lys的构象发生变化。
为研究PEI对蛋白质与脂质体相互作用可能造成的影响，笔者选用二油酰基磷脂酰丝氨酸(dioleoylphosphatidylserine，DOPS)制备脂质体来模拟细胞膜，采用动态光散射、紫外—可见光吸收光谱、荧光光谱和圆二色谱研究PEI25k对DOPS-Lys的相互作用及其对Lys构象的影响。
1实验部分
1.1材料和试剂
DOPS购自于德国Lipoid;Lys、支化PEI25k均购自于美国Sigma;实验中所有溶剂为色谱纯，来自西陇化工;实验中PBS缓冲液浓度为10mmol，pH7.4。所有的材料均未经过进一步的纯化。PEI和Lys溶解于10mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)，分别配制5mg/mL、400μmol的储液，以HCl/NaOH溶液调节pH至7.4，0～5℃保存备用，使用时以PBS稀释至所需要的浓度。
1.2实验过程及仪器
1.2.1脂质体的制备
准确称取一定量的DOPS溶于6mL氯仿—甲醇混合溶剂(体积比为2∶1)，45℃旋转蒸发去除溶剂，氮气冲刷磷脂膜30s，真空干燥过夜，加入5mLPBS进行水化，超声波分散2h后用美国默格LiposoEasyLE-1型脂质体挤出器挤压碳酸酯膜21次，所得大单层脂质体(LUV)用PBS稀释至100mL，Stewart法[15]测定磷脂含量，0～5℃保存备用。
1.2.2动态光散色
准确移取PEI储液、Lys储液、DOPS脂质体储液和PBS过滤液，配制PEI浓度系列变化的PEI-DOPS和PEI-Lys-DOPS分散液(Lys最终浓度为5μmol，DOPS终浓度为250μmol)，使用马尔文ZetasizerNanoZS型粒径电位仪测样品的粒径。
1.2.3紫外吸收光谱法
配制PEI浓度系列变化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，以相同浓度的PEI溶液作为参比，使用UV-2501PC分光光度计(日本岛津Shimadzu)测定Lys的紫外吸收光谱，波长扫描范围为200～600nm。
1.2.4荧光光谱法
配制PEI浓度系列变化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，用RF-6000荧光分光光度计(日本岛津Shimadzu)测定Lys发射荧光光谱(λex=295nm)和同步荧光光谱(Δλ=15nm)，波长扫描范围为250～450nm，激发和发射狭缝均为5.0nm。实验时以相同浓度的PEI溶液和PEI-DOPS溶液作为背景，并从最终结果中扣除。
1.2.5圆二色谱
配制PEI浓度系列变化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，使用光程为2mm的石英比色皿，在ChirascanSpectrometer型CD光谱仪(英国AppliedPhotophysicsLtd公司)室温下测定Lys圆二色谱，波长扫描范围为190～260nm，采样间隔为0.5nm，响应时间为0.5s。同样实验条件下测定相同浓度的PEI溶液及PEI-DOPS溶液的圆二色谱，其影响在最终结果中扣除。
2结果与讨论
2.1PEI对Lys-DOPS脂质体稳定性的影响
粒径是反映脂质体结构稳定性的重要参数，为了解PEI对Lys-DOPS脂质体稳定性的可能影响，分析了DOPS脂质体在含Lys和PEI溶液中流体动力学直径的变化，结果见图1。制备的DOPS脂质体在PBS中的流体动力学直径约为78.3nm，添加少量PEI导致脂质体流体动力学直径急剧增大，在cPEI25k=0.01mg/mL附近达到最大值后迅速减小，cPEI25k>0.1mg/mL时，脂质体流体动力学直径基本不变并与无PEI溶液中结果相仿。这一结果与Yasuhara等[16]的研究相吻合，Yasuhara认为PEI在DOPS脂质体表面的静电结合引起脂质体表面电位的变化，少量PEI引起脂质体产生膜融合，高浓度的PEI导致脂质体表面电位发生反转而阻碍膜融合的产生。
图1同时显示，PEI-Lys-DOPS脂质体分散液脂质体粒径也有相似的变化规律，不同的是Lys的存在使得脂质体粒径变化更为显著，表明Lys与脂质体结合并导致脂质体膜结构发生变化。研究显示，Lys通过静电作用结合在DPPG脂质体表面，蛋白质部分插入磷脂双分子层。Gorbenko等[13-14]的研究显示Lys与PG、PS磷脂膜的静电相互作用导致Lys及磷脂膜结构的变化，Lys部分嵌入磷脂双分子膜疏水碳氢区域。
2.2吸收光谱
紫外—可见光吸收是分析蛋白质构象变化的常用方法，为了了解PEI25k对DOPS脂质体-Lys相互作用的可能影响，测定了PEI浓度系列变化的DOPS脂质体-Lys-PEI25k溶液的吸收光谱，考虑到PEI25k对Lys构象的影响，同时测定了Lys-PEI25k溶液的吸收光谱，结果见图2。在PBS中，Lys分别在216nm和281nm出现一个强的吸收峰，分别有蛋白质骨架肽键n→σ*跃迁和芳香族氨基酸残基的π→π*跃迁产生[17]。由图2可见，Lys-PEI溶液中Lys在216nm处的吸收峰随PEI的浓度增加而增强，并伴有轻微的红移，表明PEI与Lys作用形成了复合物并可能导致Lys二级结构的变化[17]。PEI25k与DOPS的相互作用使Lys骨架肽键吸收强度下降，最大吸收波长红移，然而随着PEI浓度的增大，Lys在216nm处吸光度急剧增大，最大吸收波长明显红移，说明DOPS增强了PEI与Lys的相互作用。
2.3荧光光谱分析
荧光光谱被广泛应用来研究蛋白质三级结构变化。蛋白质的主要荧光由色氨酸残基和酪氨酸残基贡献，两者的荧光光谱发生相互叠加，采用295nm激发波长避免酪氨酸残基与色氨酸残基之间的共振能量转移，由于蛋白质分子构象变化对后者发射荧光的影响，同时利用同步荧光光谱法(Δλ=15nm)获得酪氨酸残基的荧光特征，结果分别见图3和图4。
色氨酸对所处微区环境的变化很敏感，峰位发生红移说明其所处微区环境疏水性减弱或极性增强[18]。Lys具有多个色氨酸残基，分布在蛋白质表面和疏水内核[19]，因此由图3可见，Lys色氨酸残基最大荧光发射波长出现在338nm附近[19]。随着溶液中PEI浓度的增加，Lys色氨酸荧光发射波长没有发生明显变化，说明其所处微区极性没有发生变化，但是可能由于与PEI结合减少了水分子碰撞引起的动态猝灭，其荧光强度略有增加。DOPS脂质体的存在使得Lys色氨酸荧光强度增加，最大发射波长兰移，说明色氨酸残基所处微区环境极性下降，Lys分子可能嵌入DOPS脂质体双分子层，这一结果与Tsunoda[12]和Kinnunen[13]的研究相一致。PEI-Lys-DOPS脂质体分散液中Lys色氨酸荧光强度进一步增加，最大发射波长兰移更加明显，说明PEI与DOPS的结合造成脂质体膜内环境的疏水性增加。
与色氨酸残基相比，酪氨酸残基的荧光对溶剂极性的变化不敏感。由图4可以看到，随着溶液中PEI浓度的增加，Lys酪氨酸残基最大荧光发射波长基本保持不变，但是其荧光强度略有增加。DOPS的存在使Lys酪氨酸残基的荧光变化更为明显，这一规律与色氨酸残基荧光相类似，说明酪氨酸残基荧光的变化不是由于蛋白质构象变化引起的酪氨酸残基与色氨酸残基之间共振能量转移的变化造成的，而应该归因于与PEI和DOPS脂质体相互作用减少了溶剂分子的碰撞猝灭。
2.4圆二色谱
圆二色光谱是分析蛋白质二级结构的常用工具，在远紫外区(190～260nm)的圆二色光谱与蛋白质的α-螺旋和β-折叠含量有关[20]。本文测定了Lys-PEI溶液体系和Lys-PEI-DOPS溶液体系中的远紫外CD光谱，结果见图5。Lys在208nm和222nm处出现两个显著的负峰，这是α-螺旋结构的特征峰[21]。实验发现，PEI对Lys二级结构的影响很小，但是DOPS脂质体使得Lys在208nm和222nm圆二色椭圆度负值略有减小，溶液中添加PEI使得这一规律更加明显，说明PEI增强了DOPS与Lys的相互作用，并导致Lys的α-螺旋结构结构减少。
3结论
PEI分子具有大量的氨基基团，易于与Lys和DOPS脂质体结合形成复合物。PEI与Lys的结合对Lys的构象影响不明显，但是PEI与DOPS的静电结合能引起脂质体膜结构的变化并对脂质体与Lys的相互作用产生影响。在水溶液中，Lys与DOPS脂质体结合，部分嵌入脂质体双分子层的疏水区，导致溶菌酶α-螺旋结构的减少，PEI与DOPS脂质体的结合增强了脂质体膜内疏水性及其与Lys的相互作用。
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