摘要:病原微生物是危害人类健康的最主要影响因素之一,快速、准确地鉴定病原微生物对保障人类健康具有重要意义。环介导等温扩增技术(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是一种新型的等温核酸扩增技术,具有特异性高、灵敏度高、快速、经济、简便的优点。可以与其他新技术结合,弥补其引物设计困难和易被污染的不足,使其能够在更多领域应用,尤其是在资源贫乏地区的基因检测以及食品的快速检测和基层检测。本文就环介导等温扩增的基本原理、特点及在病原微生物检测中的应用对近些年的研究进展进行综述,并对环介导等温扩增未来发展方向进行展望,为环介导等温扩增技术的进一步发展提供参考。
关键词:环介导等温扩增;病原微生物;基本原理;快速检测;基层检测
1引言
我们生活在微生物的时代,微生物影响着我们生活的方方面面。我们一方面享受着微生物带来的便利,如品尝着醇香的白酒,享用着美味的奶酪等。另一方面,我们也饱受微生物的困扰,由各种微生物带来的食物中毒,病菌感染时刻威胁着我们的身体健康,这些能够引起人类或动物疾病的微生物又被称为病原微生物,它包括病毒、细菌、真菌、原生动物等[1]。它们可以通过空气、食物等途径传播且传播速度极快[2]。因此,对病原微生物进行快速的检测能够让我们提前发现并解决其带来的危害。在过去的几十年里,病原微生物检测和鉴定方面取得了巨大进步,现有的检测方法主要有传统培养法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法,以及以此类方法为基础、多学科交叉发展起来的新型检测技术,如传感器技术、生物芯片技术等。传统培养法检测结果相对精确,但耗时太长,若同时检测大量样品,工作量大且效率不高。免疫学检测方法检测结果灵敏度高,特异性强,检测时间相对较短,但依赖于昂贵的检出设备,难以普及至基层检测。分子生物学检测方法中聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(reverse-transcription-polymerasechainreaction,RT-PCR)、实时荧光定量-聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction,real-timePCR)等是现在应用较广的检测技术,但这些方法较为繁琐或是依赖于较昂贵的设备,难以适用于现场检测。
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环介导等温扩增技术(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等[3]开发的一种等温核酸扩增技术。它依靠2对引物,在恒定的温度(61~65℃),在具有高链置换活性的DNA聚合酶作用下,以脱氧核糖核苷三磷酸为原料进行DNA合成反应。反应能在1h内完成,具有快速、简易、高特异性,不依赖于昂贵检测设备的优点[4],使其能够用于资源贫乏地区的基因检测、食品和环境样品的快速检测及现场检测。本文就LAMP的原理、特点及近些年的发展及应用进行综述,并对其未来发展作出展望,为环介导等温扩增技术的进一步发展提供参考依据。
2环介导等温扩增技术原理、特点及应用
2.1基本原理
LAMP的引物数量一般是4~6条。在设计时,先确定目标基因上的6个特异性区域F3、F2、F1、B1、B2、B3(图1),F1c和B1c的熔解温度(Tm)一般在64~66℃,F2、B2、F3、B3的Tm一般为59~61℃,然后依据这6个特异性区域设计4条引物:正向内引物(forwardinnerprimer,FIP),由F1c和F2组成;反向内引物(backwardinnerprimer,BIP),由B1c和B2组成,中间均以TTTT作为间隔,内引物长度一般在30~44个碱基;外引物F3、B3分别由目的基因上的F3、B3区域组成,长度一般为15~20个碱基。Nagamine等[5]提出增加一对促环引物LF和LB参与反应,可以提高扩增效率,将反应时间缩短三分之一甚至二分之一。
LAMP主要有3个阶段,第一阶段,模板合成阶段,在LAMP反应体系中,内引物的浓度几倍于外引物的浓度,因此,内引物会先与模板链结合合成互补链,形成DNA双链。随后外引物再与该模板链结合,形成DNA双链,在BstDNA聚合酶的作用下,释放出由内引物合成的互补链,该互补链经过一系列反应最终形成具有哑铃结构的DNA单链,该单链是后续循环扩增的模板。第二阶段,循环扩增阶段,以哑铃结构DNA单链自身为模板依据第一阶段的反应原理不断形成一端开口的过渡性茎环结构DNA。该DNA链作为第三阶段的反应模板。第三阶段,延长和再循环阶段,由内外引物引导过渡性茎环结构DNA不断发生链置换延伸反应,最后形成具有多个茎环结构和花椰菜结构的长度不一的DNA混合物[5]。
2.2环介导等温扩增技术特点及其发展
2.2.1LAMP特点
LAMP将模板加入反应体系中进行扩增,扩增结束后目视观察即可判断反应是否发生,步骤简单;LAMP的等温扩增特性使其只需一个恒温水浴锅就能满足反应要求,仪器成本低;同时它也不需要进行DNA的变性及复性步骤,节省了反应时间。其次,4条引物的特异性识别,提高了扩增效率。LAMP结果观察和产物检测主要有3种方法,一为浊度法,LAMP反应过程中会生成焦磷酸镁沉淀,通过观察是否产生沉淀判断反应是否发生,同时由于沉淀的产生会改变反应液的浊度,因此可测定实时浊度实现LAMP的定量检测[6,7]。二为荧光检测法。在LAMP反应体系中加入二价锰离子和钙黄素,若反应成功扩增,在紫光灯或是日光的照射下能看到溶液颜色为明亮的绿色[8],可以实现LAMP的不开盖可视化检测,避免气溶胶污染。后续研究发现,SYBRGreen染料具有比钙黄素更高的灵敏度,向反应体系中加入相应比例的荧光染料,测定反应的实时荧光值,可实现LAMP的定量检测。三为凝胶电泳法。将反应产物进行琼脂糖电泳,根据是否看到阶梯状条带判断反应是否发生。
2.2.2逆转录环介导等温扩增
逆转录环介导等温扩增(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)基本原理与操作与常规LAMP基本相同,不同的是扩增模板使用的是RNA,需在反应开始前向体系内加入逆转录酶。RT-LAMP具有与LAMP相似的灵敏度和特异性。
2.2.3多重环介导等温扩增
多重环介导等温扩增(multiplexloop-mediatedisothermalamplification,multiplexLAMP)是指在单管反应体系试剂内加入几组引物进行扩增反应,扩增产物通过酶切反应、实时荧光或是实时浊度测定实现对多种病原微生物的特异性检验[9]。其优点是在保证特异性和灵敏度的前提下提高检测效率,节约试剂成本和时间成本,但也存在一些不足,首先,所需引物数量多,为避免形成引物二聚体及二级结构,发生非特异性扩增,对引物的要求变高,增加了引物设计的难度。其次,在对扩增产物进行酶切分析时,存在酶切时间长,酶切产物不单一,结果难以准确判断以及开盖可能造成的气溶胶污染等问题。对扩增产物进行实时荧光或是实时浊度测定,进行熔解曲线分析能够很好地避免气溶胶污染以及检测时间长的问题,但也存在仪器成本较高、操作繁琐,不适用于基层检测以及目前最高只能进行四重反应等问题。
2.2.4与横向流动装置结合的逆转录环介导等温扩增
横向流动装置(lateralflowdevice,LFD)是一种基于试纸条的色谱检测平台,利用反应体系中异硫氰酸荧光素FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交,然后在横向流动试纸条上进行抗原抗体结合及显色,完成结果判断[10]。利用LFD检测RT-LAMP扩增后的产物,可以有效地降低假阳性概率,简化操作步骤,同时节省时间。但其需要设计特异性探针,一定程度上增加了检测成本。
2.2.5微流控环介导等温扩增
微流控是将样品分析从前处理到反应再到结果检测等一系列连续操作过程整合到一个微型芯片上,从而实现分析过程自动化的一项技术。该技术可以为LAMP核酸检测系统提供形状、大小不同的微量密闭反应通道及微反应空间,可以较好避免气溶胶污染,提高检测结果准确性[11]。但它也存在不足,如灵敏度不高,DNA样本需经过前处理富集、微流控装置需要专门设计以及微流体材料选择等问题。
2.2.6乳液微滴数字分析技术与环介导等温扩增结合
乳液微滴数字分析技术是属于数字核酸检测技术dNAD的一种,主要是使用乳液密封磁珠的方法,与磁珠的单分子捕获和磁珠原位LAMP扩增反应相结合构建一个高通量的数字核酸检测平台[12]。该平台可以在1.5h内完成样本的检测,并且可以达到300个拷贝/mL的检测限和实现高精度的绝对定量。
3环介导等温扩增反应在病原微生物检测中的应用
3.1LAMP在细菌快速检测中的应用
在细菌检测方面,传统的分离培养法一直是检测的金标准,但是该方法步骤繁琐、费时、费力,使用更简便的检测方法是未来的必然需求。LAMP具有快速、特异性高等优点,使其能够应用到细菌检测。目前,国内外已有不少关于其应用的研究。如Yano等[13]使用LAMP对肠毒素大肠杆菌进行检测,其最低检出限为4CFU/mL;樊粉霞等[14]利用RT-LAMP对血液样本中的伤寒沙门氏菌进行检测,最低检出限为7CFU/mL,与RT-PCR比较,其灵敏度更高。在LAMP反应中,样品中存在的死菌会影响扩增结果。与DNA相比,RNA更容易在死菌中降解,扩增结果不易出现假阳性结果。梁玉林等[15]以金黄色葡萄球菌的RNA为模板进行RT-LAMP,结果表明只要扩增检测结果不大于107CFU/mL,就能很好地避免由于死菌扩增造成的假阳性结果。一些研究结果表明,LAMP对鲜肉[16]、奶粉和速冻水饺[17]中的金黄色葡萄球菌检测具有较好的检出限。Chen等[18]在提取DNA模板后,用叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide,PMA)溶液对DNA模板进行一定时间的处理,也可以很好地排除死菌的干扰,除此之外,叠氮溴化丙锭环介导等温扩增(PMA-LAMP)检测瓜果中的鼠伤寒沙门氏菌灵敏度比叠氮溴化丙锭-聚合酶链式反应(PMA-PCR)高100倍。但是PMA是一种强烈致癌物质,不适合推广使用。Xia等[12]建立了一个基于蒙特卡罗方法、泊松统计和化学计量学理论的数学模型,并制造了一个带有1200个均匀和离散反应室(9.6nL)的螺旋芯片,该螺旋芯片实现了核酸浓度(跨越度超过4个数量级)的定量分析,将该芯片与LAMP结合,形成数字化环介导等温扩增(dLAMP),使用该法对病原性DNA样品进行绝对定量,最低检出限可达87copies/mL。金婷婷[19]将免疫捕获技术与LAMP技术结合,使用免疫捕获技术预处理待检测的人工污染全脂乳,再用LAMP法检测样品,最低检出限可达到8CFU/mL,而Ravan等[20]未使用该预处理技术的LMAP法的检出限仅为103CFU/mL。其最低检出限有了显著提高,同时在保证检测结果准确性的前提下,也缩短了样品前处理时间。Connelly等[10]设计了一种基于纸质微流体的集成备,配合手持紫外灯和手机相机,对人血浆中的大肠埃希氏菌进行了半定量检测。Tamura等[21]将扩增难治性突变系统(amplificationofrefractorymutantsystems,ARMS)与LAMP结合起来,建立了扩增难治性突变系统-环介导等温扩增,该方法能够对流感嗜血杆菌中的ftsI基因中的核苷酸(1578T)进行物种特异性检测,而不扩增β-内酰胺酶阴性氨苄青霉素抗性中携带点突变(T1578G/A)的序列。最低检出限为10.0pg/reaction。Feng等[22]利用寡核苷酸适配子磁捕获技术(adaptivemuonmagneticcapture,AMC)与LAMP技术结合来实现对李斯特菌的准确、快速检测,检出限为5CFU/mL,整个检测过程耗时约3h。其他应用[23-30]见表1。
3.2LAMP在真菌快速检测中的应用
在真菌检测方面,实现对真菌的快速检测与鉴定,对诊断、治疗和预防由真菌以及其代谢产物引起的疾病有重要意义。Ferrara等[31]使用LAMP法对纯培养的青霉菌进行检测,最低检出限为102fg/reaction;Vogt等[32]使用LAMP法检测人工污染葡萄中的草酸青霉菌,最低检出限为100pg/reaction;Luo等[33]使用Real-timeLAMP法检测花生样品中的黄曲霉,通过实时浊度仪对反应液的浊度进行实时测定达到定量的目的,该法最小检出限为102分生孢子/g;Kasahara等[34]对多条引物之间的组合进行优化,对反应液的浊度进行实时测定,成功实现了5种酵母菌的多重检测且最小检出限能达到100~103cells/mL。其他应用[35-42]见表1。
3.3LAMP在病毒快速检测中的应用
病毒能够引发各种人类、动物以及植物疾病。病毒在感染宿主后,通常会有一段时间的潜伏期,在这期间,病毒不会对宿主造成任何的破坏,而这段时间是我们治愈病毒性疾病的黄金时间。所以对病毒进行快速、精确的检测在临床方面具有重要意义。Zhong等[43]使用LAMP对临床样本中的人类乳头状瘤病毒进行检测,最低检出限为1000copies/reaction;Curtis等[44]用RT-LAMP对血液中的HIV-1进行检测,最低检出限能达到10-100copies/reaction;Nguyen等[45]用RT-LAMP对血液中的乙型肝炎病毒进行检测,最小检出限为2.218fg/μL;Gadkar等[46]设计了一种标记的环状探针,在未与目标基因结合时保持淬灭状态,在与目标基因结合后会发出强烈的荧光,从而实现对目的基因的特异性检测。该技术被称为自猝灭环荧光探针-环介导等温扩增(fluorescenceofloopprimeruponselfdequenching),使用该方法检测水痘带状疱疹病毒,最小检出限为102copies/µL;Fang等[47]将LAMP技术整合至一个八通道微流体芯片中,通过实时测量吸光度值实现伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)的定量检测,最小检出限为10fg/µL。Jung等[48]将免疫层析试纸条与多重环介导等温扩增技术结合,对几种甲型流感病毒进行检测,最小检出限为10copies/reaction。其他应用[49-55]见表1。
3.4LAMP在原生动物快速检测中的应用
原生动物大多是不致病的,只有极少数会引起疾病,如阿米巴变形虫会引起阿米巴痢疾、孢子虫会引起疟疾等。Yan等[56]用LAMP法检测家蚕卵中的家蚕孢子虫,最低检出限能达到10孢子/mL;Mwendwa等[57]用LAMP法检测溶组织内阿米巴,最低检出限能达到30pg/mL;Yang[58]用LAMP法检测棘阿米巴,最低检出限为10copies/25μL。Lass等[59]用LAMP法检测空气中的刚地变形虫,最低检出限为102卵囊/cm2(过滤网表面积);Adaszek等[60]用LAMP法检测狗身上的犬巴贝斯虫,最低检出限为0.1pg/μL。其他应用[61-63]见表1。
4总结与展望
综上所述,LAMP具有快速、简便、特异性好、灵敏度高等优点,同时它也存在引物设计复杂、反应体系易污染、扩增产物难定量等不足。弥补LAMP的不足能够使它更好地应用于检测行业。因此,LAMP未来主要发展方向有,(1)进一步优化引物设计程序,降低引物设计难度。(2)与其他新技术结合,开发出更为廉价、准确、简便的闭管检测方法,避免气溶胶污染。(3)寻找一种更为精确的核酸定量方法,解决LAMP扩增产物难以准确定量的难题。(4)开发廉价的检测设备及检测仪器设备的小型化和微型化。(5)与其他新技术结合,解决多重LAMP难以达到四重以上的局限,实现真正意义上的高通量检测。
