[摘要]红细胞是人体血液中含量最高的细胞成分。与传统的基于合成材料的载体相比，红细胞载体具有易获得、容量大、生物相容性高、循环时间长、消除机制安全等显著优势。自20世纪70年代以来，对红细胞载体药物已进行了广泛深入的研究，其中不少研究成果已展现出良好的临床应用前景。本文从载药方法、主要优势和不足等方面，综述了近几年来红细胞载体药物的研究成果，为相关领域的研究提供参考。
[关键词]红细胞;载体药物;药物递送系统
近年来，为解决脂质体、纳米颗粒等基于合成材料的药物载体在生物相容性、半衰期和安全性等方面存在的问题，研究人员将目光开始聚焦到基于天然材料的仿生型药物递送系统上来[1]。很多药物进入体循环后会与红细胞发生相互作用，红细胞在这些药物的生物分布和代谢过程中扮演着重要角色，研究人员由此产生了主动利用红细胞作为药物递送载体的想法[2]。
与合成药物载体相比，红细胞具有循环周期长、易获得、比表面积和体积较大、生物相容性高、消除机制安全等特点。1953年，研究人员首次尝试利用红细胞运载化学物质。自1973年起，研究人员开始系统研究红细胞载体药物，到目前已形成了几个主要的研究方向：①将分离得到的红细胞膜包被在载药纳米颗粒外层，构建仿生纳米载药系统[3];②利用红细胞制备细胞外囊泡包载药物[4];③利用完整的活红细胞直接负载药物。笔者认为，利用红细胞载药是在提高载药效率和保证红细胞生理功能完整性之间寻求平衡。前2种载药策略对红细胞结构和功能完整性的破坏都比较大，主要利用了少部分红细胞膜的性质。而第3种载药策略，可更充分发挥红细胞的优势。本文主要涉及基于完整活红细胞的载药策略。
1载药方法
1.1将药物包封进活态红细胞内
1.1.1低渗预膨胀法该技术主要是基于红细胞的渗透特性。将红细胞置于梯度低渗溶液中(例如180和120mOsm/kg)，使其达到溶血临界点，此时细胞膜上出现200～500Å的孔洞，药物通过孔洞进入红细胞后再将红细胞转移至等渗溶液中，红细胞恢复正常形态，膜表面孔洞关闭，将药物保留在红细胞内。Attia等[5]采用此法制备了载普伐他汀壳聚糖纳米凝胶的红细胞，结果显示出良好的肝靶向能力。Harisa等[6]将紫杉醇包封进人红细胞，包封率46.36%，红细胞回收率75.94%。Hamidi等[7]将干扰素-2b(IFN-2b)包封进红细胞，包封率(14.53±2.94)%，红细胞回收率(83.61±0.49)%，结果显示出良好的网状内皮系统靶向能力。EryDel公司的Magnani[8]基于此方法，设计了名为“RedCellLoader™”的红细胞载药专用设备(中国发明专利：CN102985079A;美国发明专利：US2013101463A1)。利用该设备采用低渗预膨胀法将地塞米松-21磷酸盐包封进红细胞，用以治疗慢性阻塞性肺病、肺囊性纤维化等疾病，目前正在美国等国家进行Ⅲ期临床试验。
1.1.2低渗透析法该方法同样基于红细胞在不同渗透压环境下能够发生可逆膨胀和回缩的特点，与预膨胀法不同的是，红细胞与调节渗透压的溶液以半透膜分隔开。在实验室条件下，可将装有红细胞悬液的透析袋置于低渗溶液中，药物预先溶解在红细胞悬液或者低渗溶液中;红细胞膨胀至膜表面出现孔洞，药物通过孔洞进入红细胞后，将低渗溶液更换为等渗溶液封闭孔洞，药物保留在红细胞内。Bax等[9]采用该法将腺苷脱氨酶(adenosinede⁃aminase，ADA)包封进红细胞，用以治疗腺苷脱氨酶缺陷。对1名患者进行了长达17年的临床试验，取得了良好的治疗效果，且未产生明显副作用。2006年，EryTech公司的Bourgeaux等[10]以此方法为基础开发了名为“ERY-caps™”的红细胞载药专用设备(中国发明专利：CN101031339A;美国发明专利：US2014154797A1)，将L-天冬酰胺酶包封进红细胞，用于治疗急性淋巴细胞白血病，目前正在美国等国家进行Ⅲ期临床试验。
1.1.3高渗法高渗法操作简单，将红细胞在50%的高渗葡萄糖溶液中脱水，然后在含有药物的低渗或者等渗溶液中重涨，使药物顺红细胞内外的渗透压差进入红细胞[11]。采用高渗法制备的载吗啡红细胞进行家兔体内实验，证明药物作用时间较普通吗啡注射液显著延长[12];用于胸部手术后患者镇痛[13]，以及老年患者全髋关节置换术的术后镇痛[14]，效果良好。采用此法包载抗癌药物甲氨蝶呤，包封率较高，体内消除时间明显延长[15]。但高渗法的主要问题是会对红细胞造成一定损伤。笔者在利用高渗法包封药物时，对处理后的红细胞进行血液成分分析，观察到血小板计数(plateletcount，PLT)明显升高，提示处理过程可能对红细胞造成较大损伤，产生了血小板样碎片。
1.1.4电穿孔法该方法的基本原理是在等渗溶液中以电击方式诱导红细胞膜发生渗透性的改变;跨膜电位差导致在红细胞膜上形成孔，药物分子从孔隙进入红细胞中[10]。采用此法可将重组人白细胞介素-2包封进红细胞，包封率为5%～7.5%[16];包封双氯芬酸钠，引入红细胞的药物平均浓度可达4.21mmol/L[17];包封乙醇脱氢酶(alcoholdehydroge⁃nase，ADH)和乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)的红细胞载体包封率和红细胞回收率良好，单独包封ADH和共包封两种酶的红细胞，体外实验中可在70h内连续有效降解乙醇[18]。
1.1.5穿膜肽介导法He等[19]采用穿膜肽(cellpenetratingpeptides，CPP)介导的药物内化方式，将L-天冬酰胺酶包封进红细胞。这种载药方式不会对红细胞膜造成明显伤害，具体来说是基于CPP介导的非选择性细胞内化现象，将待包封的蛋白质药物与低相对分子质量鱼精蛋白(一种CPP)通过二硫键共价连接;CPP-蛋白质复合物进入红细胞以后，二硫键在细胞质谷胱甘肽的作用下降解，CPP和蛋白质分离，蛋白质药物包封在红细胞内。
1.1.6化学物质诱导内吞法Ginn等[20]发现某些特殊结构的化学物质(例如伯胺喹)可诱导红细胞的内吞作用，从而将药物包封进红细胞。采用这种方式将伯氨喹包封进红细胞，每ml红细胞可包封0.1～0.15mg药物[21];包封普伐他汀，包封率可达94%，红细胞回收率87%～93%[22]。但是该方法有一个比较突出问题，就是只能用于包封同时具有疏水和亲水基团的阳离子或阴离子药物。
1.1.7渗透脉冲法渗透脉冲法的基本原理是使红细胞在短暂而强烈的渗透压力作用下发生瞬时的物质交换。利用该方法将肌醇六磷酸(inositolhexaphosphate，IHP)包封进红细胞，可制备低氧亲和力的红细胞[23]。先向红细胞混悬液中加入二甲亚砜(DMSO)，在红细胞内外建立高渗透压;然后向红细胞混悬液中迅速加入含有IHP的等渗溶液，细胞外部DMSO浓度迅速下降，在红细胞膜两侧迅速建立渗透压梯度。这种瞬时梯度导致水和药物内流、细胞膨胀和膜的通透性增加。室温下这个渗透过程持续约1s。Mosca等[24]对比了低渗透析法和DMSO渗透脉冲将IHP包封进红细胞的包封率等参数。该法制备的红细胞包封率高，但是1次只能处理很少数量的红细胞(红细胞总数的9%～25%)。
1.1.8共包封(药物结合蛋白)法对于具有良好跨膜渗透能力的药物来说，直接包封进红细胞难以产生明显的缓释效果。研究人员将药物结合蛋白和药物一起包封进红细胞。Hamidi等[25]将苯妥英和牛血清白蛋白一起包封进红细胞，与单纯包封苯妥英相比，载药量提升了8倍，药物释放更加可控，且载药细胞未产生明显的特性改变。Biagiotti等[26]将亲免素蛋白(immunophilin)FKBP12和CypA分别包封进红细胞，使他克莫司和环孢素A的载药量提高了一个数量级。
1.2将药物连接到活红细胞膜上
早期研究者的注意力多集中在将药物包封进红细胞内部，忽略了对红细胞膜的利用。实际上，单个红细胞膜表面积160μm2，也是良好的载药平台，而且将药物偶联到红细胞膜上能在一定程度上减小对红细胞结构和功能的损害[2]。
1.2.1化学连接20世纪80年代初，研究者们已经测试了数种将蛋白质分子与红细胞膜上的基团共轭连接的方法，例如使用非特异性化学交联剂戊二醛。戊二醛可连接药物分子的氨基与红细胞膜上的游离氨基，载药细胞进入血液循环后，在水解酶作用下释放药物。用戊二醛将柔红霉素连接到红细胞膜上，并对14名白血病患者进行了药代动力学和耐药性的初步研究[27]。静脉给药后，药物的峰浓度和消除率显著低于游离柔红霉素，且患者的耐受性较好。将链激酶连接到红细胞上，连接效率可达90%，该复合物可溶解血管内的纤维蛋白凝块[28];将巯基化的低相对分子质量肝素，通过一种偶联试剂连接到红细胞上，该复合物有长期抗凝和预防血栓的潜能[29]。
后来研究者们开发了特异性更强的连接方式，利用生物素-亲和素系统将生物素化的化学物质连接到红细胞膜的某些靶点上。Cowley等[30]通过不同的方法，对红细胞膜表面的41种抗原进行了生物素化修饰，拓展了该技术的应用范围。Magnani课题组[31]对两种红细胞体外生物素化的方式进行对比，借助生物素N-氢琥珀酰亚胺酯(biotinN-hydro⁃succinimideester，NHS-生物素)与红细胞膜氨基连接，或是通过生物素酰肼氧化红细胞膜上的诱导醛基，前者红细胞回收率可达90%以上。该课题组后用生物素化的方式将抗Thy-1.2单克隆抗体偶联至红细胞，将红细胞靶向淋巴细胞[32]。也有研究采用生物素化的方式将抗人IgM的单克隆抗体连接到红细胞上[33]。
1.2.2红细胞搭便车技术Brenner等[34]开发了“红细胞搭便车”技术(redbloodcell-hitchhiking，RH)，它是将药物纳米颗粒吸附到红细胞上，然后通过静脉注射或者动脉血管插管的方式输注给患者;进入血液循环后，纳米颗粒由于剪切应力或与内皮细胞直接接触而解吸附。因此该载药方式适于将药物靶向到注射下游的第1处毛细血管富集器官。该法可有效改善纳米载体药物肝脾摄取严重、体内靶向性差等问题[35]，配合临床上使用的血管插管治疗方式，可大幅度提升纳米载体药物的器官靶向能力。例如将载药脂质体吸附到红细胞上，静脉注射后，在肺部富集提升40倍;用此法递送FDA批准上市的溶栓药物Reteplase，可有效改善小鼠肺动脉栓塞(pulmonaryembolism，PE)症状;配合颈动脉血管插管注射RH纳米颗粒，可将超过10%的纳米载体递送到脑。RH药物递送系统的器官靶向能力显著优于目前常用的亲和配体方式，例如RH药物递送系统的肺部靶向能力，与已有20年临床使用经验的anti-RECAM抗体相比高约14倍;在脑血管靶向方面，目前报道效果最好的脑靶向亲和配体转铁蛋白，也只能将注射剂量1%的药物靶向到脑部，而RH-水凝胶纳米颗粒，脑部摄取可达到12%[34]。
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但是该药物递送系统也存在一些问题：①药物纳米颗粒与红细胞连接不牢固，易发生解吸附;②目前利用该系统实现心、脑等器官的靶向，需要借助动脉血管插管，因此适合急性、严重疾病，不适合大多数慢性、门诊治疗的疾病[36]。
1.2.3将治疗药物靶向到循环红细胞在体外制备药物-抗体/多肽复合物，然后将这种复合物注入体内，靶向连接到循环红细胞上，能在一定程度上避免体外操作和重新输注引发的问题。该方法能以红细胞表面的多种抗原为靶点，例如免疫黏附受体CR1、Rh&RhAG家族蛋白质、Kell蛋白质、Band3阴离子通道蛋白、血型糖蛋白、糖转运蛋白1(glu⁃cosetransporter1，Glut1)家族、Dombrock血型系抗原和其他的高表达抗原[36]。
将组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivator，tPA)共轭连接到CR1的单克隆抗体上，制备anti-CR1/tPA复合物，该复合物进入血液循环后连接到红细胞上，可赋予红细胞纤维蛋白溶解活性[37]。在体外实验中，红细胞连接该复合物可引起90%的纤维凝块溶解，在人CR1转基因小鼠体内实验中，该复合物可有效加速肺栓塞的裂解。糖蛋白A(glycoproteinA，GPA)在人类红细胞上的表达都超过5×105拷贝数，高于CR1;将tPA[38]和尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinaseplasminogenactivator，uPA)[39]分别与对小鼠GPA具有特异性的单链抗体可变片段(single-chainvariablefragment，scFv)融合，得到抗GPAscFv/PA复合物和scFv/uPA-T复合物，体内实验证明这两种复合物都具有出色的血栓预防功能。
类似的载药方法还可用于清除体内的病原体。用红细胞表面抗原CR1的抗体-C3b和一种病原体的抗体共轭结合得到复合物-双特异性单克隆抗体复合物，该复合物可同时特异性结合红细胞表面抗原CR1和病原体;向实验动物注射模型病原体，继而注射该复合物，发现其可高效实现红细胞介导的病原体清除[40]，例如二硝基酚-牛γ-球蛋白(dinitrophenol-bovineγglobulin，DNP-BGG)[41]、大肠杆菌[42]和马尔堡病毒[43]，而且红细胞不会被裂解或吞噬。
2红细胞载体药物的优势
2.1改善药物靶向性
某些试剂，如双(磺基琥珀)辛二酸酯[bis(sulfo⁃succinimidyl)suberate，BS3]和ZnCl2，可使红细胞表面抗原性质发生改变，模拟细胞衰老过程，使红细胞靶向到巨噬细胞[44]。较早的关于红细胞巨噬细胞靶向性的报道见于20多年前，Magnani等[45]采用上述方法将包载1型人类免疫缺陷病毒(humanim⁃munodeficiencyvirustype1，HIV-1)、猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，FIV)等逆转录病毒抑制剂的红细胞进行膜处理后靶向到巨噬细胞。
除了对巨噬细胞具有天然靶向性之外，红细胞还可通过一些处理实现其他部位的靶向性。缪婉琳等[46]将Fe3O4纳米颗粒包封进红细胞，制备磁化红细胞和磁化载多柔比星红细胞。在外加磁场的引导下，磁化的载多柔比星红细胞可准确靶向肿瘤细胞。Wang等[47]将Fe3O4纳米颗粒外包被光敏剂二氢卟吩e6(chlorine6，Ce6)并连接PEG，然后将该复合物通过生物素化的方式连接到红细胞膜上，红细胞内包封多柔比星，制备了载多柔比星的红细胞-磁性纳米颗粒-Ce6-PEG磁响应药物递送系统。Gao等[48]将光敏剂Ce6连接到红细胞膜，低功率光照使Ce6产生单线态氧，有效破坏红细胞膜，可实现对包封在红细胞内的药物光响应释放。Xia等[49]将胰岛素包封进红细胞，再通过生物素化的方法将葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOx)修饰到红细胞膜上，制备糖响应的载胰岛素红细胞。血液中葡萄糖在GOx作用下分解成葡萄糖酸和过氧化氢，后者裂解红细胞释放胰岛素，实现血糖调控。
2.2血液循环中的生物反应器
在红细胞中包载酶，可作为血液循环中的生物反应器。例如将L-天冬酰胺酶包封进红细胞，底物天冬酰胺进入红细胞被酶降解，从而清除血液循环中的天冬酰胺[10]。已有数种解毒酶利用类似的方法被包封进红细胞。例如可将硫氰酸酶和有机硫代磺酸盐包封进红细胞，用于氰化物解毒[50];或者将重组磷酸三酯酶包封进红细胞，磷酸三酯酶可将对氧磷水解为毒性较小的4-硝基苯酚和二乙基磷酸酯，在小鼠体内可显著对抗对氧磷的致死作用[51]。
2.3实现药物的超长缓释
正常人红细胞的寿命为100～120d，如果能够充分利用这个特点，可制备超长循环的药物载体。将药物直接包封进红细胞，可在一定程度上延长药物的循环半衰期。例如将甲氨蝶呤包封进红细胞，游离甲氨蝶呤消除半衰期为(3.9±0.8)h，载甲氨蝶呤的红细胞消除半衰期为(13.5±2.0)h[15]。但是这种将可渗透过膜的脂溶性药物直接包封进红细胞，任由其渗透出红细胞膜的方法，显然不能充分利用红细胞的长循环优势。
为此，Magnani团队提出了磷酸化前药的载药策略。该策略是将磷酸化前药包封进红细胞内，在红细胞内酶(例如5′-核苷酸酶)的作用下，转变为活性产物释放出细胞，从而实现药物的缓释。自1988年起，他们分别将5-氟-2′-脱氧尿苷[52]、2′，3′-双脱氧胞苷[53]、叠氮胸苷[54]、氟达拉滨[55]等药物的磷酸化前药包封进红细胞，使这些药物的半衰期得到了显著的延长。该团队最成功的尝试，是将地塞米松的非扩散性前药地塞米松-21磷酸盐包封进红细胞，在相关酶的作用下，转变为可渗透性的地塞米松释放出红细胞。单次处理50～70ml血液并回输，可在患者体内维持治疗浓度达3～4周[8]，目前正在美国等国进行Ⅲ期临床试验。
3结语
1973年Ihler等发表以红细胞包载酶的第1篇论文，其后研究者们尝试了用红细胞递送各类药物。这些有益尝试拓展了红细胞载体药物的应用范围。但是目前仍有一些需要克服的问题：①载药红细胞的储存和质量控制困难;②载药过程会损害红细胞结构和功能的完整性，带来一些局部和全身的副作用[56]。随着研究深入，相信这些问题可被逐一克服，红细胞载体药物必定能给药学发展带来重大变革。
