【摘要】目的观察姜黄素预处理对干热环境热射病大鼠心肌氧化应激及细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法50只SD雄性大鼠随机分为5组(n=10):常温对照组(NC)，干热对照组(DHC)，姜黄素50mg/kg预处理组(L-cur)，姜黄素100mg/kg(M-cur)，姜黄素200mg/kg(H-cur)。NC、DHC组给予生理盐水灌胃，姜黄素预处理组给予不同浓度的姜黄素灌胃，每天1次，连续7天。第8天除NC组外，其余4组大鼠转移至西北特殊环境人工实验舱内进行实验，环境温度(41±0.5)℃，湿度(10±1)%。实验的第150分钟达到热射病状态，麻醉后取材，用全自动生化检测仪检测大鼠血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的变化，用TUNEL法检测心肌细胞凋亡并计算心肌细胞凋亡率。检测心肌超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)的含量，并进行相关性分析。结果干热对照组大鼠血清心肌酶CK、LDH、心肌细胞凋亡指数、MDA较常温对照组显著升高(P<0.01)，姜黄素预处理组CK、LDH、心肌细胞凋亡指数、MDA均随药物浓度增加而降低，姜黄素各个预处理组之间差异具有显著性(P<0.01);SOD的变化趋势与MDA相反。相关性分析提示，心肌细胞凋亡与大鼠血清心肌酶CK、LDH之间存在正相关性(相关系数分别为r=0.302，r=0.304，P<0.05);心肌细胞凋亡与MDA之间存在正相关性(相关系数为r=0.916，P<0.01);心肌细胞凋亡与SOD之间存在负相关性(系数为r=-0.863，P<0.01)。结论姜黄素预处理对干热环境热射病大鼠心肌损伤具有保护作用，姜黄素可能通过抗氧化应激、减少细胞凋亡来发挥心肌损伤保护作用。
【关键词】姜黄素;干热环境;热射病;大鼠;心肌;凋亡;氧化应激
随着全球变暖，中暑的发生率呈逐年上升趋势。中暑(heatstroke)是一种紧急而又威胁生命的疾病，特点是体温超过40℃，它可能导致心、肝、肾、肺、凝血系统和中枢神经系统等多个器官功能紊乱，热射病是中暑的严重类型，具有高死亡率和多脏器功能障碍(MODS)特性[1-2]。中暑引起的全身炎症反应综合征可导致心肌细胞凋亡，在心脏损伤中起重要作用[3]。姜黄素是一种从姜黄中提取的多酚化合物，对抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗微生物有很好的疗效，在保护心、肺、肝、肾及脑神经方面也有很好的作用[4-5]。已有大量实验数据表明，氧化应激在心血管疾病的发病机制中起着重要作用，包括动脉粥样硬化、高血压、血管内皮功能障碍和缺血性心脏病。细胞氧化应激导致内皮细胞和血管平滑肌细胞释放有毒的自由基，这些细胞与蛋白质、DNA或脂质等细胞成分相互作用，导致心血管病变[6]。姜黄素预处理能否有效保护热射病引起的心肌细胞相关损伤，降低其凋亡水平，并减少氧化应激引起的相关损伤目前尚未见有关报道。本研究应用姜黄素预处理后，建立热射病大鼠模型，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminaldexynucleotidyltransferase(TdT)-mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)检测心肌凋亡细胞，并结合血清心肌酶和心肌组织氧化应激指标，探索姜黄素预处理干热环境热射病大鼠心肌细胞的保护作用及其可能机制。
1材料和方法
1.1实验动物
SPF级雄性SD大鼠50只，8～10周龄，购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，实验动物许可证编号[SCXK(新)2016-0001]，体重220～260g。动物饲养在温度:(25±2)℃，湿度:(35±5)%RH，SPF级动物实验室，自由摄取食水，使用许可证编号[SYXK(新)2016-0003]。按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。
1.2主要试剂与仪器
西北地区特殊环境人工实验舱(新疆军区总医院研制)，全自动生化仪(MindrayBS180)，BI2000图像分析系统(成都泰盟科技公司)。姜黄素购自日本化成株式会社，羧甲基纤维素钠购自源叶生物，TUNEL试剂盒系Abcam公司产品，丙二醛(malondialdehyde，MDA)(生产批号:20160114)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)(生产批号:20160309)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3实验方法
将SD大鼠放置在SPF室内适应性饲养1周每12h明暗交替。随机将大鼠分为5组:①常温对照组(normalcontrol，NC)，生理盐水灌胃;②干热对照组(dry-heatcontrol，DHC)，生理盐水灌胃;③低剂量姜黄素预处理组(L-cur)，50mg/kg姜黄素+5%羧甲基纤维素钠溶液配置成混悬液灌胃;④中剂量姜黄素预处理组(M-cur)，100mg/kg姜黄素+5%羧甲基纤维素钠溶液配置成混悬液灌胃;⑤高剂姜黄素预处理组(H-cur)，200mg/kg姜黄素+5%羧甲基纤维素钠溶液配置成混悬液灌胃;各个实验组连续灌胃7d，大鼠自由饮食饮水(均经灭菌处理)。在实验的第8天，除常温对照组外，其余4组大鼠转移至由新疆军区总医院自行研制的人工气候舱(西北特殊环境人工实验舱)内，环境温度(41±0.5)℃，相对湿度(10±1)%，禁食禁水。复制以前建立的热射病大鼠模型[7]，在实验开始的150min，将大鼠腹3%戊巴比妥腹腔麻醉后处死，取下腔静脉血液保存并离心15min，-80℃保存，全自动生化检测仪检测血清肌酸激酶(creatinekinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)水平。TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡(按说明书方法进行)，并在光学显微镜下观察，计算凋亡率;阳性细胞即为凋亡细胞核，表现为棕色;显色蓝色细胞核的细胞为正常细胞400倍视野下拍照，每张切片随机选取5个视野统计凋亡细胞数及总细胞数，取其平均值。计算心肌细胞凋亡指数(apoptoticindex，AI)=凋亡细胞数(TUNEL阳性)/总细胞数(DAPI阳性)×100%。染色及计数均采用双盲法。检测心脏组织中SOD活性及MDA水平，取心脏组织于冷生理盐水中匀浆，按试剂盒方法进行操作，采用比色法检测SOD活性及MDA水平。
1.4统计方法
使用SSPS23.0软件分析，计量资料采用平均数±标准差(x珋±s)表示，组间比较应用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1姜黄素对热射病大鼠血清心肌酶的影响
大鼠血清心肌酶CK、LDH结果同时显示，DHC组明显高于NC组(P<0.01)，姜黄素预处理组随着浓度的增加，各项指标均呈下降趋势，各浓度组与DHC组之间及各浓度组之间均差异有显著性(P<0.01)。见表1。
2.2心肌细胞凋亡率
显微镜下观察:凋亡细胞核染呈棕色(图1)，DHC组凋亡指数[(41.31±2.69)%]明显高于NC组[(5.23±0.97)%]，低、中、高姜黄素预处理组凋亡指数分别为(30.00±3.93)%、(15.39±2.53)%、(10.55±1.55)%，呈逐渐下降趋势，与DHC组均存在显著性差异(P<0.01);姜黄素组间比较差异均有显著性(P<0.01)。
2.3姜黄素对热射病大鼠心脏组织氧化应激的影响
MDA在DHC组明显高于NC组(P<0.01)，DHC组MDA最高，随着姜黄素预处理组浓度的增高，MDA呈逐渐下降趋势，各个浓度组与DHC组之间及各个浓度组之间均有显著性差异(P<0.01);SOD在NC组最高，DHC组最低，两者均有显著性差异(P<0.01)，随着姜黄素预处理组浓度的增加，SOD水平呈上升趋势，其中各个浓度组之间及各浓度组与DHC组之间均存在显著性差异(P<0.01)。
2.4相关性分析
姜黄素各处理组及对照组中各项指标经Pearson相关分析提示，心肌细胞凋亡与大鼠血清心肌酶CK、LDH之间存在正相关性(相关系数分别为r=0.302，r=0.304，P<0.05);心肌细胞凋亡与MDA之间存在正相关性(相关系数为r=0.916，P<0.01);心肌细胞凋亡与SOD之间存在负相关性(系数为r=-0.863，P<0.01)。
3讨论
已有研究表明，心肌细胞凋亡参与沙漠干热环境中暑过程中的心肌损伤，姜黄素预处理可以延长沙漠干热环境中暑大鼠的生存时间[8-9]，因此推测姜黄素可能通过抑制心肌细胞凋亡来发挥心肌损伤保护作用。本研究结果提示，不同浓度的姜黄素预处理可明显降低心肌细胞凋亡率和心肌酶CK、LDH的数值，且心肌细胞凋亡与大鼠血清心肌酶CK、LDH之间存在正相关性，提示姜黄素预处理可能是通过减少心肌细胞凋亡在热射病大鼠心肌损伤保护过程中发挥作用。研究发现姜黄素预处理后心肌氧化应激指标丙二醛(MDA)明显下降，而具有抗氧化酶作用的超氧化物歧化酶(SOD)明显上升，并在Pearson相关分析中首次发现心肌细胞凋亡与MDA呈正相关，与SOD呈负相关，表明姜黄素预处理可通过改变热射病大鼠心肌氧化应激水平来减少心肌细胞凋亡。
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SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除体内自由基;而MDA与线粒体膜的稳定性呈负相关，因此通过测定两者情况可以评估机体内氧自由基水平[10-11]。在干热应激下，活性氧(ROS)的增加，血浆和心脏组织中检测到的抗氧化能力也随着ROS的增加而降低，SOD水平降低。目前研究认为，ROS过量的产生会干扰心脏相关基因的表达，对心脏相关基因的表达产生不利影响，包括细胞迁移、分化、细胞增殖和细胞凋亡，这是导致心脏损伤的主要原因。Wang等[12]研究发现，AngII受体拮抗剂缬沙坦，有效缓解了氧化应激，阻断AngII信号通路，抑制了湿热应激诱导的心肌细胞凋亡。此外，抗氧化基因的过表达逆转了AngII诱导的心肌细胞凋亡，热应激会增加氧化应激，并通过AngII信号通路引起心肌细胞凋亡。在心肌组织发生缺血缺氧损伤的过程中，氧化应激反应及细胞凋亡的过度激活是造成心肌细胞损伤的重要病理环节。氧化应激是炎症反应中的重要环节，在心肌炎症反应过程中可产生大量氧自由基，导致膜脂质过氧化，再经过氧化物酶分解生成MDA，最终造成肌纤维过度收缩，三磷酸腺苷耗竭，线粒体超微结构损害，使依赖能量的离子泵活性降低，进而促进钙超载，可诱导心肌细胞凋亡[13-14]。线粒体不仅是肌细胞的动力源和能量来源，而且还能调节细胞内Ca2+的稳态，产生中间代谢物/活性氧(ROS)等细胞过程[15]。Li等[16]研究结果表明热应激诱导产生活性氧(ROS)的细胞增加，同时线粒体凋亡通路的活性增加。
在沙漠干热环境下机体内会出现较多的氧自由基积聚，机体抗氧化能力降低，表现为SOD的降低和MDA的升高，进而损伤心肌线粒体功能的同时引起凋亡通路的活性增加，从而加重心肌组织损害。姜黄素是从中药姜黄中分离的重要活性成分，其具有抗炎症反应、抗氧化应激损伤、抗凋亡以及抗肿瘤等药理活性。本研究认为，姜黄素可能通过抗氧化应激、提高线粒体膜稳定性，在减少心肌细胞凋亡来发挥干热环境下中暑大鼠的心肌保护作用。
