摘要:为了研究长期定位施肥对棕壤中氨氧化细菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)种群结构多样性和垂直分布特征的影响,本研究采用化学分析、荧光定量PCR(qPCR)和变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,针对沈阳农业大学试验区不同施肥方式(不施肥、低量无机氮肥、高量无机氮肥、无机氮肥与有机肥配施)下不同土壤深度(0~20cm、20~40cm、40~60cm)的土壤理化性质、AOB丰度及种群多样性进行分析,比较不同施肥方式对土壤AOB种群的影响。结果显示,与不施肥相比,施肥会降低土壤pH,增加土壤铵态氮(70.5%~939.21%)和硝态氮(253.20%~625.48%)含量。随土壤深度增加,土壤pH升高,铵态氮和硝态氮含量除低量无机氮肥处理外,多呈降低趋势。土壤增施氮肥可提高AOB丰度,降低总细菌丰度。其中,0~20cm土层中AOB丰度较高,且高量无机氮肥处理的AOB数量最高,为9.65×105拷贝数·g-1(干土)。DGGE图谱分析显示,不同处理下,AOB群落结构多样性指数存在明显差异(P<0.05),各多样性指数均在表层(0~20cm)最高,增施氮肥则显著降低AOB的多样性。聚类分析表明,4个施肥处理中,高量无机氮肥处理聚为一类,其他处理则因土壤深度不同而异;3个土壤深度中,除不施肥处理外,所有施肥处理均表现为0~20cm、20~40cm土层发生聚类,40~60cm则明显与其他两层分开。冗余梯度分析(RDA)显示,硝态氮(P=0.027)是造成影响AOB群落结构差异的主要原因。上述研究结果表明,长期定位施肥土壤AOB的数量和群落结构多样性受施肥方式显著影响,并表现出明显的垂直分布特征。与无机氮肥相比,有机无机配施处理有助于改善土壤pH,维持不同土壤深度下AOB群落结构多样性。
关键词:棕壤;施肥方式;氮肥;氨氧化细菌(AOB);群落结构;土壤深度
硝化作用是土壤氮素转化的关键过程,由氨氧化细菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizingarchaea,AOA)驱动的氨氧化过程作为硝化作用的限速步骤,可通过其数量、多样性、结构组成的改变来响应土壤氮素转化[1]。许多研究指出,酸性土壤中长期施肥可改变AOA的丰度和群落结构,中性或碱性土壤中AOB比AOA更敏感。Chen等[2]在研究水稻(OryzasativaL.)酸性红壤发现,各施肥处理中AOA丰度变化明显,而AOB几乎没有区别。Wu等[3]研究小麦(TriticumaestivumL.)中性土壤中发现,长期施肥(22年)显著改变AOB的群落结构,而AOA则保持不变。近年来,Hayatsu等[4]在日本茶园土壤中成功分离出嗜酸性AOB,使得这类微生物在酸性土壤中的作用有了新的认知。研究表明,土壤pH、氮素种类、土壤类型、施肥方式和作物品种等因素,均可对氨氧化微生物产生特异的选择性。Fan等[5]研究长期施肥水稻土指出,AOB的数量和群落结构较AOA变化明显,增施氮肥可显著提高AOB的多样性。Ai等[6]发现,小麦与玉米(ZeamaysL.)轮作潮土中,施加氮肥可显著提高AOB数量。Kumar等[7]和Liu等[8]研究酸性土壤时均指出,配施有机肥可显著增加土壤中AOB的数量和群落结构多样性。Ouyang等[9]在美国的犹他州粉砂壤土中也发现,有机氮肥可显著提高AOB-amoA基因丰度,且氨氧化细菌的活性随有机肥料增加而增加。
相关期刊推荐：《中国生态农业学报》1993年创刊。由中国科学院遗传与发育生物学研究所;中国生态经济学会主办。主要刊登土壤、施肥与植物营养、水资源及其高效利用、作物水分生理生态、农业高效栽培技术与机理、作物抗性生理生态、抗性育种、病虫害防治、生物多样性保护、资源优化配置及其效益分析、农业生态工程技术、无公害农产品生产技术、农业环境污染防治及农业可持续发展等方面的研究报告、研究简报及综述,以及生态农业建设和生态农业示范区建设典型模式与典型经验等。有投稿需求的作者，可以咨询期刊天空在线编辑。
农业生态系统中,不同施肥方式可通过影响土壤理化特征,改变功能微生物的丰度及群落结构组成,进而对土壤质量和生态功能产生影响。许多研究表明,较单施化肥相比,无机有机氮肥配施的农田管理模式,有助于优化土壤微生物群落结构,改良土壤理化属性和养分供应状况,维持并提高土壤质量。Kumar等[7]研究长期施肥的水稻土时指出,无机有机肥配施可以缓解土壤酸化,稳定土壤功能和丰富功能基因。Zhao等[10]研究小麦与水稻轮作的黏土时指出,无机有机肥配施可显著提高土壤有效养分、微生物量以及微生物多样性,对于可持续的农业生产来说,无机有机肥配施是一种较好的施肥方式。然而,在长期施肥模式下,针对棕壤中氨氧化细菌群落结构多样性对不同施肥方式,特别是有机无机肥配施的响应特征,及其随土壤深度增加的变化差异等相关研究少有报道,这些研究结果对于探索不同施肥模式下土壤氮素转移与变化规律具有指导意义。
为进一步认识长期定位不同施肥模式下棕壤氨氧化细菌的变化特征,采用PCR-DGGE和qPCR技术,以沈阳农业大学长期定位试验田为平台,比较4种施肥方式下,长期定位棕壤AOB的丰度与种群结构差异,同时结合土壤理化性质的分析,探讨AOB对不同施肥方式的响应机制和垂直分布特征,为维持土壤质量、稳定生产力提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料与样品采集
试验地位于辽宁省沈阳市沈阳农业大学长期定位试验站(41°49′N,123°34′E),该地区属于大陆性季风气候,年平均气温8.0℃,年均降水量为705mm。土壤类型属于中厚层棕壤。长期定位试验始于1987年,种植作物为玉米。施肥方式设置为4个处理,分别为不施肥[CK,0kg(N)·hm-2]、施低量氮肥(N2,年施尿素氮135kg·hm-2)、施高量氮肥(N4,年施尿素氮270kg·hm-2)和尿素氮肥与有机肥配施(M2N2,其中尿素氮135kg·hm-2;有机肥为猪厩肥,其中含纯N135kg·hm-2)。小区面积为69m2,不同施肥处理3次重复。
土壤采集于2015年7月20日(玉米抽雄期),采用对角线五点采样法,采集0~20cm、20~40cm和40~60cm剖面深度的土壤。每个小区同一土层的土壤组成混合代表样,所取土壤去除杂物,碾碎后混匀,一部分用冰盒保存带回实验室后-80℃保存,另一部分装入自封袋带回实验室后4℃保存,用鲜土样测定硝化强度、铵态氮和硝态氮含量,剩余土壤自然风干后测定土壤pH。
1.2土壤理化指标的测定
土壤pH测定采用电位法(土∶水=1∶2.5);土壤铵态氮和硝态氮用0.01mol·L-1CaCl2浸提新鲜土样后,采用连续流动注射分析仪(AA3-HR,SEAL,Germany)测定;硝化强度的测定参照赵爽等[11]的方法。
1.3土壤微生物总DNA提取
土壤微生物DNA的提取采用E.Z.N.Z.TMSoilDNAKit(OMEGA),获得DNA后用Qubit测定浓度,并采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA质量,-20℃保存。
1.4细菌16SrDNA和AOBamoA基因的荧光定量PCR
分别用引物515F/907R和amoA-1F/amoA-2R扩增细菌16SrDNA和AOBamoA基因,PCR体系为50mL,分别含10×Buffer5.0mL,dNTP(各2.5mmol×L-1)4.0mL,上下游引物(10mmol×L-1)各1.0mL,DNA模板(1~10ng)2mL,rTaq(5U×mL-1)1.0mL,最后用ddH2O补至50.0mL。PCR程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸30s,45个循环;最后72℃延伸10min。回收PCR产物连接至pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态中,经Amp+、IPTG和X-gal的LB平板筛选阳性克隆,测序分析。
标准曲线的制作:提取测序正确的细菌16SrDNA、AOBamoA基因的阳性克隆质粒,用Qubit测其浓度,按10倍梯度稀释质粒成实时荧光定量PCR测定标准品,-20℃保存。
荧光定量PCR在ABI7500StepOnePlus上进行,反应体系为20mL,分别含GoTaq®qPCRMasterMix10.0mL,上下游引物各0.8mL(10mmol×L-1),DNA模板2.0mL(1~10ng),用ddH2O补至20.0mL。qPCR引物及程序如表1所示。
将稀释100倍的土壤DNA样品与标准品一起进行Real-TimePCR检测,包括阴性对照在内每个样品设3个重复。细菌16SrDNA基因标准曲线的R2为0.99,扩增效率为99.67%,AOB-amoA基因标准曲线的R2为0.993,扩增效率为107.73%。
1.5氨氧化细菌16SrDNA的PCR扩增
利用巢式扩增方法扩增氨氧化细菌的V3区域,反应体系为25μL,其中模板1μL、前后引物(20mmol×L-1)各0.5μL、2´TaqMasterMix12.5μL、DNA-FreeWater10.5μL。共使用3对引物8F/1492R、CTO189F/654R、341F/519R(表2),其中CTO189F/654R是针对β-AOB的一对特异性较高的引物。最后得到的PCR产物约190bp,用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后可用于DGGE分析。
1.6PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析
移取PCR产物15μL进行DGGE分析,变性剂梯度范围为35%~55%,聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%(100%的变性剂为尿素7mol×L-1和40%的去离子甲酰胺),在1´TAE缓冲液中,180V、60℃缓冲液中电泳6h。电泳后采用GeneFinder法进行染色。然后用Gel-DocXR凝胶成像系统照相保存。
1.7数据分析
数据处理采用SPSS20.0数据处理软件,差异显著性分析利用单因素方差分析(ANOVA)和多重比较法(Duncan);DGGE图谱分析采用Quantity-One图像分析软件。土壤理化因子与氨氧化微生物群落特征相关性分析采用Pearson相关分析法。用Shannon多样性指数(H)、均匀度(EH)和丰富度(S)等评价AOB群落结构多样性。采用CANOCO4.5.1软件(MicrocomputerPower,Ithaca,USA)分析AOB群落结构和土壤理化因子间的关系。多样性指数计算公式为:H=-∑(ni/N)ln(ni/N),EH=H/lnS,式中ni为单一条带的强度,N为所有条带的总强度,S为每一泳道总的条带数。
2结果与分析
2.1长期不同施肥处理下土壤理化性质的变化
不同施肥处理对棕壤理化性质产生不同影响(表3)。与不施肥相比,所有施肥处理均显著降低了0~20cm土壤的pH(4.55~5.47);同时,施加无机肥的N2和N4处理显著降低40~60cm土壤pH,而施加有机肥的M2N2处理则表现出相反结果(P<0.05)。同一施肥处理下,0~20cm土壤pH不同程度地低于其他土壤深度。土壤氮素含量表现为,与不施肥相比,所有施肥处理均可显著增加土壤NH4+-N(0.51~5.30mg·kg-1)和NO3--N(6.24~45.27mg·kg-1)的含量(P<0.05)。除N2处理外,同一施肥处理中,0~20cm土壤铵态氮与硝态氮含量均不同程度高于其他土壤深度。N2处理在相同土壤深度下,与CK处理间硝化强度无明显差异,M2N2与N4处理可明显增加表层土壤(0~20cm)硝化强度。
2.2长期不同施肥处理下土壤总细菌和AOB数量的变化
以16SrDNA和细菌amoA基因为靶标,用荧光定量PCR测定土壤总细菌和AOB的数量。结果显示,不同施肥处理下土壤总细菌数量为4.30×109~7.27×1011拷贝数·g-1(干土)。与不施肥相比,所有施肥处理均显著降低了0~20cm土壤细菌的数量;各施肥处理间,在相同土壤深度下,N4处理土壤细菌数量均不同程度地低于N2和M2N2处理。相同施肥处理下,M2N2土壤细菌数量在不同土层中差异不明显,其他处理均表现为40~60cm土壤细菌数量均显著低于0~20cm土层(图1)。
土壤AOB的数量为1.31×105~9.65×105拷贝数·g-1(干土)。与不施肥相比,低量氮肥处理N2显著增加了不同深度土壤中AOB数量,高量氮肥处理N4中AOB在20~40cm土层迅速升高,在0~20cm和40~60cm土层则显著降低。有机无机肥配施处理(M2N2)对0~40cm土壤中AOB无明显影响,却显著降低40~60cm土层AOB数量(图1)。总体上,土壤施肥后,细菌和氨氧化细菌主要分布在0~40cm土层区域中。
土壤AOB与总细菌的数量比值为45.4~55.2。施肥总体上增加了二者的比值,且无机氮肥对二者比值的增加不同程度地高于无机有机氮肥配施处理(M2N2),该结果应与增施氮肥后土壤细菌数量下降有关。
2.3长期不同施肥处理下土壤AOB细菌群落结构的变化
2.3.1DGGE图谱
DGGE技术是研究微生物种群结构的免培养手段之一,尽管检测通量有限,且只能检测生境中数量占优势的微生物种群,该技术重现性强、检测速度快、价格经济、结果直观等特点,使其一直被广泛应用于不同生境中微生物种群多样性及空间分布检测等相关领域[15-16]。不同施肥方式下土壤AOB群落结构的DGGE图谱见图2A。不同处理土壤AOB群落结构的DGGE图谱在电泳条带数目、强弱和迁移位置均存在一定程度的差异,显示出AOB对环境因子变化的响应特征。与不施肥相比,施肥处理土壤AOB的条带数减少。图中的共有条带(8、14和19)说明不同施肥处理土壤存在共有的AOB类群,但其亮度不同,说明这些AOB可能通过数量改变来响应环境的变化。条带17、22只存在于不施肥(CK)处理土壤中,而条带9、10、18只存在于高量无机氮肥(N4)处理土壤中,说明这些AOB类群对土壤中氮素变化较为敏感。聚类分析显示(图2B),12个处理(施肥处理´土层)聚为两大类群,N4处理单独聚成一类,且0~20cm与20~40cm土层土壤之间的相似性达71%,说明施加高量无机氮肥可明显改变土壤中AOB的群落结构。另外,所有供试处理0~20cm与20~40cm土层土壤明显聚为一类,说明AOB群落结构在0~20cm和20~40cm土层较为相似,但在深层土壤(40~60cm)发生明显变化。
