要:为了探究连香树水提物和乙醇提取物的主要成分和抗氧化作用，该研究采用水提和醇提两种方法提取连香树叶片中的代谢物并测定其主要成分，通过体外抗氧化实验，即清除羟自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)、超氧阴离子(O2-·)和还原铁离子(Fe3+)的能力等四个指标来评价其抗氧化作用。结果表明:连香树水提物和乙醇提取物中均含有山萘酚。此外，水提物中还含有苜蓿素和异槲皮苷等黄酮类物质;乙醇提取物中还含有柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类物质。水提物和乙醇提取物均有清除羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子及还原三价铁离子的能力。抗氧化的作用随提取物浓度的增大而增强，其中清除超氧阴离子(IC50值分别为0.092、0.002mg·mL-1)的能力强于阳性对照Vc(IC50值为0.241mg·mL-1)且铁离子还原力的IC50值(水提物为0.014mg·mL-1，乙醇提取物为0.001mg·mL-1)相对较小，说明其总抗氧化活性较强。由此可见，连香树水提物和乙醇提取物均具有良好的抗氧化作用，可作为一种潜在的天然抗氧化剂。
关键词:连香树，水提物，乙醇提取物，抗氧化作用
连香树(Cercidiphyllumjaponicum)别名山白果，是连香树科连香树属的一种古老稀有的落叶大乔木，被国家列为二级保护植物(姚连芳和李宏瀛，2005)，主要分布在日本和我国四川西部和东南部、山西南部、湖北西部等海拔400～2500m的常绿和落叶阔叶混交林中(黄绍辉，2007)。连香树其味芳香，百米可闻。树姿高大雄伟，叶型对称美观(郭郢和王安明，2004)。根、茎、叶均可作药用，特别是树皮煎水饮服，对治疗感冒、痢疾有特殊疗效(陈仲平，2005)。树皮和叶均含有鞣质，可提取烤胶(姚连芳和李宏瀛，2005)。因此，连香树具有较高的观赏价值和经济价值。目前对连香树的研究报道大多是关于通过组培、快速繁殖(麦苗苗，2006;袁丽洁，2008;陈荣珠等，2012)等方法来恢复扩大其资源，而连香树次生代谢产物及其功能开发等方面的研究还不够完整，特别是抗氧化、抗癌等方面的研究尤为少见。该文拟对连香树叶片次生代谢物的主要成分及成分的抗氧化作用情况做一探索。
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天然植物抗氧化剂是一类无毒、安全的抗氧化剂，具有重要的生物活性(张泽生等，2017)。它能有效清除机体受到氧化应激时产生的过多的自由基，使机体的氧化还原系统处于动态平衡(温朋飞和彭艳，2017)。研究表明，传统合成的抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等本身可能具有潜在毒性，对人体造成危害，所以寻找低毒、安全、高效的天然植物抗氧化剂成为了一种必然趋势(熊皓平等，2001)。目前，许多植物的提取物均具有良好的抗氧化作用，且不同方法、不同溶剂的提取物其抗氧化作用不同(李海亮等，2017;袁保刚等，2011;潘争红等，2016)。该文旨在以连香树叶片为试材，通过水提和醇提两种方法获取提取液并测定其中的主要成分，分别对两种提取液进行体外测定羟自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)和超氧阴离子(O2-·)三种自由基的清除实验和三价铁离子(Fe3+)的还原力来研究连香树叶片提取物的抗氧化作用，为进一步开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集与制备连香树(Cercidiphyllumjaponicum):2017年7月中旬采自海拔1800m的四川省广元市旺苍县盐井河采育场，经四川师范大学生命科学学院马丹炜教授鉴定确认为连香树Cercidiphyllumjaponicum)。在实验室将叶子摘取下来后粉碎至粉末，备用。
1.1.2试剂硫酸亚铁(FeSO4)，过氧化氢(H2O2，0.3%)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，盐酸(HCl)，邻苯三酚(1，2，3-Trihydroxybenzene)，1，1-二苯基-2-苦苯肼自由(1，1-Diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)，铁氰化钾[K3Fe(CN)6]，磷酸二氢钠(NaH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，氯化钠(NaCl)，三氯乙酸(TCA)，氯化铁(FeCl3)，抗坏血酸(Vc)，二甲基亚砜(DMSO)，无水乙醇，95%乙醇。
1.1.3主要仪器AR224CN电子天平，上海奥赛斯仪器有限公司;XH-300A祥皓电脑超声波组合合成/萃取仪，北京祥皓科技发展有限公司;RE-52CS旋转蒸发仪，上海雅荣生化设备仪器有限公司;CHASHB-3A循环水式多用真空泵，北京恒奥德科技有限公司;HH-4恒温水浴锅，江苏金城国胜实验仪器厂;TGL-16B离心机，上海安亭科技仪器厂;多功能细胞分析仪(MD/SpectraMaxM2);老本行400Y粉碎机;色质联用仪(WatersXevoG2-XSTof)。
1.2方法
1.2.1提取方法
1.2.1.1连香树水提物的制备水煎法(史文青等，2012)，称取1150g连香树叶粉末，加入蒸馏水3200mL(1∶3)，浸泡8h后文火煎煮4h，过滤得水提取液500mL，得率为15.62%。1.2.1.2连香树乙醇提取物的制备参照焦胜敏(2014)和唐军等(2011)的方法并略做改进，称取煮过后的连香树叶粉末50g，加入300mL80%乙醇(料液比1∶6)，温度60℃，超声波功率为302W，超声时间30min。按上述方法重复5次后合并提取液过滤，转至旋转蒸发仪浓缩，得浸膏20g，得率为8%。
1.2.2连香树水提物和乙醇提取物成分的测定采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪(UPLCTOF/MS)联用技术对连香树水提物和连香树乙醇提取物进行成分分析。色谱和质谱条件参照孙国东等(2017a)的实验方法，质量扫描范围0～800m/z，数据采集时间42min。
1.2.3抗氧化作用测定
1.2.3.1羟自由基(·OH)清除能力用蒸馏水配制质量终浓度为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mg·mL-1的连香树水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001mg·mL-1的Vc阳性对照溶液;用DMSO配制质量终浓度为0.16、0.08、0.04、0.02、0.01mg·mL-1的连香树乙醇提取物。参照任秋蓉等(2017)的水杨酸法测定连香树提取物对羟自由基(·OH)的清除作用。
1.2.3.2DPPH自由基清除能力用蒸馏水配制质量终浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg·mL-1的连香树水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001mg·mL-1的Vc阳性对照溶液;用DMSO配制质量终浓度为0.08、0.04、0.02、0.01、0.005mg·mL-1的连香树乙醇提取物。参照Lietal(2012)和任秋蓉等(2017)文献中的DPPH法测定连香树提取物对DPPH自由基(DPPH·)的清除作用。
1.2.3.3超氧阴离子(O2-·)清除能力用蒸馏水配制质量终浓度为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg·mL-1的连香树水提物和3.2、1.6、0.8、0.4、0.2mg·mL-1的Vc阳性对照溶液;用DMSO配制质量终浓度为0.008、0.004、0.002、0.001、0.005mg·mL-1的连香树乙醇提取物。按照任秋蓉等(2017)文献中的邻苯三酚法测定连香树提取物对超氧阴离子(O2-·)的清除作用。
1.2.3.4铁离子(Fe3+)还原力连香树水提物、Vc阳性对照溶液和连香树乙醇提取物对照
1.2.3.2的配制方法。参照戚建华等(2012)的方法测定连香树提取物对铁离子(Fe3+)的还原力，吸光度值越大，表示样品液的还原能力越强。
1.2.4统计分析采用SPSS17.0处理数据，LSD法分析显著性差异，双变量法分析相关性，Probit法分析IC50值，使用MicrosoftExcel2010作图。
2结果与分析
2.1连香树水提物和乙醇提取物成分分析
连香树水提物和乙醇提取物经UPLC-MS测定后得两种样品的总离子流图和紫外图，分别见图1和图2。在连香树水提物的总离子流图中，逐一分析了紫外吸收峰较强的物质，以4.37min处的紫外吸收峰为例，该时间的分子量为286.1069。在二级质谱中，生成的一系列碎片离子中含有153[M+H-C8H6O2]+，与孙国东等(2017b)文献中报道的山萘酚的二级碎片离子一致，因此推测该物质为3，5，7，4’-四羟基黄酮即山萘酚，分子式为C15H10O6。同理，还分析出水提物中含有苜蓿素(王凤云等，2016)、异槲皮苷(黄辉强等，2009)等黄酮类物质;在连香树乙醇提取物的总离子流图中，以3.754min处的紫外吸收峰为例，也发现了分子量为286.1032的化合物。在二级质谱中，根据孙国东等(2017b)文献中报道的山萘酚的二级碎片进行比对，发现了有5个相同的主要二级碎片离子，分别是287[M+H]+，241[M+H-CO-H2O]+，213[M+H-2CO-H2O]+，165[M+H-C7H6O2]+，153[M+H-C8H6O2]+，可确认该物质为山萘酚。同理，还分析出了柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类物质(孙国东等，2017b)。
2.2连香树提取物对羟自由基(·OH)的清除作用
连香树提取物对羟自由基(·OH)的清除作用见图3、图4和表1。从图3和图4可以看出，随着浓度的逐渐减小，反应物颜色逐渐变深，表明两种提取物均有清除羟自由基的作用。由表1可知，连香树水提物、Vc及乙醇提取物对羟自由基(·OH)的清除率随浓度增大而增大。在低浓度时，羟自由基(·OH)的清除率仅有6.46%～16.88%的清除率，在高浓度时达到了70%，最高为89.11%，表明几种物质对羟自由基(·OH)的清除率呈浓度依赖性。经统计软件SPSS17.0进一步分析，连香树水提物的P=0.000，r=0.994;Vc的P=0.026，r=0.921;乙醇提取物的P=0.002，r=0.985，进一步说明连香树提取物的浓度与羟自由基(·OH)的清除率均呈极显著的正相关关系。
