摘要:目的利用日落黄与牛乳中蛋白质的吸附特性，探索牛乳中蛋白质的快速检测方法。方法利用比色法，探讨了离心条件、检测试剂体积、检测试剂浓度、反应时间、检测试剂酸度以及三聚氰胺、尿素等非蛋白氮对检测结果的影响，在优化好的条件下进行了实际样品的测定。结果1ml牛乳样品，10ml检测试剂，0.05%日落黄，反应时间1min，13000r/min离心20min可获得较好的检测结果，方法的相对偏差为0.86%。在1.0%～5.0%范围内，方法的标准曲线方程为y=580x2-53.271x-0.2191。建立的方法用于牛乳样品中蛋白质的测定，结果与国标一致。结论本文建立的方法可用于牛乳中蛋白质的快速测定和非蛋白氮的快速筛查，有较好的应用前景。
关键词:牛乳;蛋白质;快速;试剂盒
近年来随着我国乳制品市场的快速发展，牛乳的质量安全越来越引起消费者的广泛关注。蛋白质的含量是衡量牛乳营养价值高低的重要指标之一。GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》是测定食品中蛋白质含量的国家标准方法〔1〕，其中第一法凯氏定氮法和第二法分光光度法测定前均需将样品中的蛋白质在催化加热条件下分解，通过测定处理后生成的氨、间接获得蛋白质的含量。以上方法存在的不足是不能有效区分蛋白氮和非蛋白氮〔2〕，因此不能检测出三聚氰胺等非蛋白氮的非法添加。同时由于样品前处理过程复杂，耗时较长，国标方法尚不适于牛乳样品中蛋白质含量的快速测定〔3-5〕。本研究利用日落黄与牛乳中蛋白质的吸附特性，在样品不需要加热分解处理的情况下，通过结合前后溶液颜色的变化实现牛乳中蛋白质含量的快速检测。相关研究对于实现牛乳中非蛋白氮的快速筛查和牛乳质量监测都具有重要意义。
1材料与方法
1.1主要仪器紫外可见分光光度计，台式高速离心机TGL-16C，数显型圆周振荡器，红外消化仪，凯氏定氮仪，磁力加热搅拌器。
1.2主要试剂蛋白质标准溶液购于国家标物中心，日落黄购于上海源叶生物科技有限公司，生鲜乳取自天津市某奶牛养殖厂，市售牛奶购于天津市某超市，超纯水由Millipore公司纯水机制得。
1.3方法原理酸性条件下日落黄溶液与牛奶中蛋白质络合并变性沉淀，溶液中日落黄浓度下降，利用络合前后日落黄溶液浓度变化确定牛奶样品中蛋白质的含量。
1.4检测试剂的配制0.1%检测试剂储备溶液配制:准确称取0.2874g日落黄，纯水定容至250ml，摇匀。使用时用0.5mol/L的H2SO4稀释至所需浓度。
1.5标准曲线分别取1ml浓度为0、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%的蛋白质标准溶液与10ml浓度为0.05%的日落黄溶液混合，13000r/min离心20min后取上清液，稀释10倍后以1ml纯水样品作对照，于483nm处测定吸光度绘制标准曲线。
1.6样品测定取牛乳1ml加10ml浓度为0.05%检测试剂，13000r/min离心20min后取上清液，稀释10倍后以1ml纯水样品作对照，于483nm处测定吸光度，通过标准曲线计算牛乳中蛋白质的含量。
2结果与讨论
2.1离心时间和离心机转速的影响检测试剂与牛乳样品混合后，一方面日落黄与牛乳蛋白络合，另一方面络合后的蛋白在酸性条件下变性，因此在一定的转速条件下需确定合适的离心条件使蛋白完全沉淀。在13000r/min条件下，将10ml浓度为0.001%检测试剂与1ml牛乳涡旋混合1min后，取上清液于483nm处以纯水为参比测定吸光度。结果表明:对于10ml的检测试剂，13000r/min条件下离心20min后上清液吸光度基本稳定。
2.2检测试剂浓度的影响检测试剂中日落黄的浓度对于牛乳中蛋白的吸附效果有关键性的作用，在离心时间20min、离心转速13000r/min、检测试剂体积10ml的优化条件下，选取浓度分别为0.0005%、0.001%、0.0025%、0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.05%和0.1%的日落黄10ml，分别与1ml的牛乳混合涡旋1min离心后，取上清液稀释10倍，于483nm测定吸光度;对照样品为1ml纯水，试验方法同上。以相同浓度检测试剂对照样品与牛奶样品检测吸光度的差值为纵坐标，以日落黄浓度为横坐标，结果如图1所示。实验过程中发现浓度为0.0005%～0.01%的检测试剂在离心后上层均有悬浮物，可能是由于检测试剂的浓度过低时不能完全将牛乳中的蛋白完全吸附。从图1可以看出，随着检测试剂中日落黄浓度的增大，与牛乳反应前后体系吸光度的差值也不断增大，0.05%的检测试剂与样品混合后的反应前后吸光度差值达到最大，显色剂浓度继续增加时差值反而下降，因此实验下一步选择检测试剂中日落黄的浓度为0.05%。
2.3络合时间的影响检测试剂中的日落黄与牛奶样品的蛋白吸附需要一定的反应时间，在上述优化好的实验条件下，分别选择1、2、3、5、8、10min的反应时间，其余操作同上，测得结果如图2所示。由图中可以看出，日落黄与牛奶中蛋白的络合时间很短，反应1min以后吸光度基本趋于稳定，考虑到快速检测应尽量在较短的时间内完成，因此将混合时间确定为1min。
2.4酸度的影响检测试剂的酸度直接关系到牛乳中蛋白是否完全变性沉淀，只有保证牛乳中的蛋白被完全沉淀，测得的结果才会准确。实验选取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.5和1.0mol/L的硫酸作为日落黄的稀释溶液，按照1.6方法进行测定。以检测试剂酸度作为横坐标，吸光度与对照样品吸光度的差值作为纵坐标，结果如图3所示。在实验中可以观察到0.05～0.4mol/L酸度的检测试剂在离心后上层均出现不同程度的悬浮物，由于酸度较低使得蛋白凝固的颗粒较小，在离心过程中未能离心下去，而1.0mol/L酸度的检测试剂的灵敏度与0.5mol/L相比差别不大，故实验选择酸度为0.5mol/L的检测试剂。
2.5温度的影响考虑到现场快速检测有可能涉及室外不同的温度，实验选取20、25、30、35、40℃等几个温度，考察了反应温度对检测体系的影响，结果如图4所示。分析结果可知，温度对检测体系的影响很小，40℃时吸光度略有增大，但考虑到实际情况，一般气温不会达到40℃，故认为温度对该实验的影响基本可以忽略不计。
3方法性能
3.1干扰情况在优化好的试验条件下，试验选择几种非蛋白氮，以验证方法的抗干扰性能和在实际应用中鉴别非法添加的能力。实验分别考察了1.0g/L的尿素、三聚氰胺、甘氨酸对检测结果的影响，结果表明，在1.0g/L的浓度条件下三种干扰物对检测体系显色无干扰，说明非蛋白氮不会影响本方法的检测结果。
3.2方法精密度取1ml牛乳样品与0.05%、10ml显色剂混合1min、13000r/min离心20min后取上清液稀释10倍后，于483nm处以空白管为参比，测定吸光度，方法的相对偏差为0.86%。
3.3标准曲线在优化的最佳条件下，分别取1ml浓度为1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的蛋白质标准溶液，按照1.6方法测定，标准曲线方程为y=580x2-53.271x-0.2191，R2=0.9977，标准曲线如图5所示。
3.4样品测定分别选取了1种生鲜乳样品和2种市售牛乳样品，采用本法与GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的第一法凯氏定氮法进行测定，结果如表1所示。由表1可知，本法与国标方法的测定结果基本一致，表明本方法适用于牛乳中蛋白质的测定。
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4结论
本研究利用日落黄与牛乳中蛋白质的吸附特性，通过结合前后溶液颜色的变化实现牛乳中蛋白质含量的快速检测。实验对离心条件、检测试剂体积、检测试剂浓度、混合时间、检测试剂酸度等条件进行了优化，结果表明在离心20min、离心速度13000r/min、检测试剂10ml、检测试剂浓度0.05mol/ml、混合1min、试剂酸度为0.5mol/ml时，获得了较好的检测结果。方法与国标方法检测结果基本一致，可用于牛乳样品中蛋白质和非蛋白氮的快速检测筛查。
