摘要：木尔坦棉花曲叶病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)2006年在中国首次报道，并呈逐年扩散蔓延，给园艺和经济作物造成了严重损失。选择2012年采自江苏南京的CLCuMuV朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)分离物作为研究对象，对其V2蛋白基因进行了扩增及克隆，并构建了V2-YFP融合表达载体，利用农杆菌浸润法接种本氏烟(Nicotianabenthamiana)。激光共聚焦显微镜观察结果显示浸润处理后本氏烟叶片细胞的细胞质和细胞核周都有较强的绿色荧光信号，同时细胞质中还分布有点状的荧光信号。反转录PCR(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Westernblot)结果显示带荧光标签的V2在本氏烟叶片中转录和表达正常。这些结果说明CLCuMuV编码的V2蛋白主要分布在细胞质和细胞核周，同时在细胞质中还会形成小聚合体。
关键词：朱槿;木尔坦棉花曲叶病毒;V2蛋白;亚细胞定位
木尔坦棉花曲叶病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的单组分双生病毒，主要由烟粉虱(Bemisiatabaci)以持久循回方式传播(Harrisonetal.，1997)，危害多种作物。CLCuMuV最早在巴基斯坦木尔坦地区发现，之后巴基斯坦其他地区及印度等地有发生，给当地的棉花等作物生产造成了惨重的损失(Briddon&Markham，2000;Briddon，2010;Sattaretal.，2013)。2006年中国首次报道了CLCuMuV在广东朱槿上发生为害(毛明杰等，2008)，之后陆续在广西(林林等，2011)、福建(章松柏等，2013)、江苏(张晖等，2015)、海南(汤亚飞等，2015)等地发生，成为朱槿(毛明杰等，2008;林林等，2011;张晖等，2015)、黄秋葵(董迪等，2010，2012;Xieetal.，2011)、红麻(汤亚飞等，2015)、垂花悬铃花(汤亚飞等，2013)、棉花(Caietal.，2010)等多种植物的重大病害风险因子之一(何自福等，2012)。
相关期刊推荐：《园艺学报》(月刊)创刊于1962年，是由中国园艺学会主办的学术性期刊，刊登果树、蔬菜、西瓜甜瓜和观赏植物等方面示曾发表过的学术论文、研究报告、研究简报、专题文献、综述，经过审定或鉴定的新品种、新书介绍。主要栏目：研究论文、研究报告、研究简讯、新品种、综述、新书介绍、动态与信息。有投稿需求的作者，可以咨询期刊天空在线编辑。
CLCuMuV病毒粒体为典型的孪生颗粒状，大小18~20nm×30nm，基因组为单链环状DNA(circularsingle-strandedDNA，cssDNA)，含有1个DNA-A组分，同时伴随1个β卫星分子(Mansooretal.，2003)。DNA-A组分大小2.7~2.8kb，含有6个ORF，分别编码V1、V2、C1、C2、C3和C4蛋白，β卫星大小约1.3kb，含有1个ORF，编码βC1蛋白(Zhouetal.，1998;Mansooretal.，2003)。
在CLCuMuV编码的6个蛋白中，关于V2蛋白功能研究还相对较少。Amin等(2011a，2011b)在研究CLCuMuV巴基斯坦分离物(AJ496287、AJ496461)时发现其编码的V2蛋白是一个基因沉默抑制子，可以抑制寄主的PTGS，同时V2还是一个致病相关因子，在寄主植物中过量表达会引起叶片卷曲等症状，并伴有坏死反应，而对于其亚细胞定位特征，目前尚未见报道。
很多研究结果显示蛋白的功能与其亚细胞分布特征密切相关，研究蛋白的亚细胞定位特征一方面有利于解析蛋白的作用方式，同时也有利于发现蛋白的新功能。如东非木薯花叶喀麦隆病毒(EastAfricancassavamosaicCameroonvirus，EACMCV)编码的AV2蛋白主要分布在细胞质，而在无胞间连丝的保卫细胞中没有分布，说明AV2蛋白可能通过胞间连丝进入细胞中，推测AV2蛋白可能参与了病毒的胞间运动(Chowda-Reddyetal.，2008);Yang等(2007)在研究番茄金色花叶病毒(Tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)编码的AL2蛋白功能时发现AL2在细胞质和细胞核均有分布，在细胞核内主要负责激活病毒转录，在细胞质内主要参与抑制寄主的基因沉默。目前已有很多研究结果显示双生病毒编码的V2蛋白具有多种功能，在病毒侵染和致病过程中起着重要作用，如在CLCuMuV的近缘病毒Kokhran棉花曲叶病毒(CottonleafcurlKokhranvirus，CLCuKoV)的研究中发现，V2突变后会导致病毒的侵染效率下降，在寄主植物体内的积累量降低，植株不表现症状(Iqbaletal.，2012)。V2还参与了病毒的运动(Priyadarshinietal.，2011;Guhaetal.，2013)、致病(Mubinetal.，2010)、抑制寄主的PTGS(Saeedetal.，2015)等一系列过程。这些结果暗示CLCuMuV编码的V2可能也是一个多功能蛋白，对病毒侵染和致病起着重要作用。
本研究中选择在中国发生的CLCuMuV朱槿分离物(张晖等，2015)作为研究对象，通过基因克隆和生物信息学分析，对CLCuMuV编码的V2蛋白氨基酸序列进行了分析，构建V2-YFP融合表达载体，对V2蛋白的亚细胞定位特征进行了研究，以明确V2蛋白亚细胞定位特征，为进一步解析CLCuMuV编码的V2蛋白功能及CLCuMuV致病机理奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
CLCuMuV毒源为本实验室保存的2012年采自江苏省南京市发病朱槿样品(张晖等，2015);所用荧光标签载体35S:YFP由南京农业大学陶小荣教授惠赠。大肠杆菌感受态Trans10购自北京全式金生物公司;农杆菌菌株GV3101由本实验室保存;本氏烟(Nicotianabenthamiana)植株培养于温度为26℃、光照周期为14h光照/10h黑暗的光照培养箱中。
1.2CLCuMuVV2基因的扩增及序列分析
参照Xie等(2002)的方法，用碱裂解法提取病样总DNA。根据CLCuMuV基因组序列(JX914662)设计CLCuMuVV2基因全长扩增引物MAV2_bgF：5′-GAAGATCTATGTGGGATCCATTGTTAAACG-3′和MAV2_bgR：5′-GAAGATCTCAACCCTTTGGAACATpCCGG-3′(下划线为BglⅡ酶切位点)。以提取病样总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系：DNA模板2μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各2μL，10×PCRBuffer(Mg2+plus)5μL，dNTPMixture4μL，TaKaRaTaq(5U·μL-1)0.25μL，加入ddH2O使反应液定容至50μL，离心混匀后进行PCR。PCR反应程序：94℃预变性5min;94℃变性45s，51℃退火45s，72℃延伸40s，33个循环;72℃充分延伸10min;4℃保存。经1%琼脂糖凝胶，0.5×TAE缓冲液和150V电压下电泳，0.5μg·mL-1溴化乙锭(EB)染色15min后于凝胶成像系统中观察。将扩增所得的目的片段进行割胶回收操作，DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段后，连接至pMD18-T载体，连接体系：4.5μL目的片段回收产物，5μLSolutionI，0.5μLpMD18-TVector，16℃连接过夜，将连接产物通过热击转化法转入大肠杆菌感受态Trans10，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱中倒置过夜培养，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆委托南京金斯瑞生物公司进行测序。序列分析利用NCBI(http：//ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST在线分析工具及本地ClustalX、BioEdit、DNAstar等软件完成。
1.3CLCuMuVV2-YFP融合表达载体的构建
将测序验证无误且读码框正确的阳性克隆提取质粒后用BglⅡ进行单酶切，对目的条带进行切胶回收，纯化后的目的条带通过T4连接酶连接经BamⅢ单酶切的35S:YFP载体，连接体系：目的片段回收产物7μL，1μLT4DNALigase(350U·μL-1)，1μL10×T4DNALigaseBuffer，1μL线性化(经过BamⅢ单酶切)35S:YFP载体，16℃连接过夜，连接产物通过热击法转入大肠杆菌感受态Trans10，涂布于含硫酸卡那霉素的LB平板上，于37℃恒温培养箱中倒置过夜培养，PCR筛选阳性克隆并进行序列测定，测序验证无误后获得重组质粒V2-YFP。
1.4CLCuMuVV2蛋白的亚细胞定位
电击转化参照王碧(2015)的方法将重组质粒V2-YFP及35S:YFP空载体质粒转化农杆菌GV3101，涂布于含利福平及硫酸卡那霉素的LB平板上，28℃恒温培养箱中倒置培养48h。挑取单菌落进行PCR检测，筛选阳性克隆。
瞬时表达参照邱礽等(2009)的方法，28℃摇床过夜培养至OD600为0.8时收集菌体，用新鲜配置的浸润液MMA(10mmol·L-1MgCl2;10mmol·L-1MES以及0.1mmol·L-1AS)重悬菌体，调OD600为0.5，室温静置2h。选取4~6叶期健康的本氏烟幼苗，用去除针头的无菌注射器浸润处理本氏烟叶片。进行3次生物学重复，每次生物学重复浸润8~10株，每株浸润3片叶片，每片叶均有两个浸润点。浸润后的本氏烟置于25℃培养箱培养。40h后切取叶片浸润区制作临时玻片，于激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM710)488nm激发光下观察上皮细胞中目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位特征。核定位观察时用DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)标记细胞核：先取观察样品用DAPI染色，10min后洗脱染色液，于激光共聚焦显微镜下观察荧光。
1.5CLCuMuVV2转录产物的RT-PCR检测
为了验证V2-YFP在本氏烟叶片细胞中是否正常转录，称取浸润处理的本氏烟叶片组织0.1g在液氮中充分研磨，参照郭思瑶等(2015)的方法，用TRIzol®Reagents提取总RNA，根据PrimeScriptTMRTreagent试剂盒方法合成cDNA。以上述cDNA为模板，利用V2全长扩增的上游引物(MAV2_bgF)和位于YFPN端的引物(EGFP-N)进行PCR检测。
1.6CLCuMuVV2蛋白的Westernblot分析
称取0.4g浸润处理(40hpi)的本氏烟叶片，用蛋白抽提液(100mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0;6%SDS;2%β–巯基乙醇)进行总蛋白抽提，95℃变性10min，冰浴5min，12000r·min-1离心5min，取上清液，即为Westernblot试验蛋白样品。取适量蛋白样品于12%SDS-PAGE胶上进行电泳(80V，1h;130V，1h)。将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸润20s激活，在电转缓冲液中通过湿转转膜仪将凝胶转移到膜上(260mA，1h)。取出PVDF膜，用1×PBST清洗3次，加入封闭液(利用1×PBST配制的5%脱脂奶粉)，室温120r·min-1振荡1h，用1×PBST清洗3次;加入GFP抗体，4℃孵育过夜后用1×PBST清洗3次;加入二抗(羊抗兔)，室温120r·min-1振荡孵育1h，再用1×PBST清洗3次。参照ECLWesternBlottingSubstrate显色试剂盒避光显色5min。在天能Tanon5200Multi全自动荧光/化学发光成像分析系统下进行观察。
2结果与分析
2.1CLCuMuVV2基因克隆
鉴于CLCuMuV编码的V2基因本身含有BamHⅠ酶切位点，本研究中采用的35S:YFP载体的多克隆位点只有一个BamⅢ，因此在设计V2基因全长扩增引物时引入了BglⅡ酶切位点(兼容BamⅢ)。利用该引物，以病样DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增到一条约400bp的特异条带,与CLCuMuV编码的V2基因(366bp)大小一致。回收该片段，连接克隆载体pMD18-T，转化大肠杆菌，菌落PCR筛选阳性克隆，经测序验证无误后获得重组质粒pMD18T-V2。
2.2CLCuMuVV2蛋白的氨基酸序列特征分析
CLCuMuV江苏分离物V2基因核苷酸序列全长366bp，编码一个含有121个氨基酸约14kD的蛋白，该蛋白与之前报道的江苏分离物(JX914662)编码的V2蛋白氨基酸序列完全一致。
除江苏分离物外，对已报道的CLCuMuV其他分离物编码的V2蛋白氨基酸序列也进行了分析，结果(图1)发现各分离物编码的V2氨基酸序列非常保守。本研究中获得的V2氨基酸序列除与广东(HQ455353、HQ455363)、广西(JQ317603)部分分离物存在一个氨基酸突变外，与海南(KF766955、KF766953、KF444948)、福建(JX861210)、云南(KF766947)及广东(KF766951、KF766949、KF766945、HQ455361、JN968573、HQ455349、HQ455348)、广西(HQ455357、HQ455356、HQ455355、GU574208、GQ924756、GQ503175)其他分离物的氨基酸序列完全一致。CLCuMuV中国分离物编码的V2氨基酸序列与巴基斯坦及印度等分离物V2氨基酸序列差异较大。
2.3CLCuMuVV2-YFP融合表达载体的构建
鉴于克隆V2基因时分别在基因的两端引入了BglⅡ酶切位点，因此通过BglⅡ酶切pMD18T-V2获得了V2基因。在利用琼脂糖凝胶电泳分析pMD18T-V2经BglⅡ酶切产物时发现有两条片段。其中一条大小在2000~3000bp之间，与pMD18-T大小一致。另一条大小约400bp，与366bp的V2大小一致。回收大小约400bp的目的片段，通过T4连接酶将其连接经BamHⅠ(与BglⅡ酶切位点兼容)处理后纯化回收的YFP空载体质粒，转化Trans10感受态细胞，利用载体引物35SF和EGFP-N经PCR进行阳性克隆筛选(图2，A)。
鉴于V2基因是经单酶切后插入35S:YFP载体，因此V2可以正向插入，亦可反向插入，为了保证插入方向正确，对筛选到的阳性克隆进一步利用引物35SF和MAV2_bgR进行菌落PCR筛选(图2，B)，并进一步测序进行验证，测序结果正确的阳性克隆命名为V2-YFP，从而获得带有YFP标签的V2重组表达载体。
