【摘要】毛细管电泳是一种新型的分析技术，具有高柱效、高选择性、快速分离、低溶剂消耗、分离模式多等特点。其应用涉及到分析领域的各个方面，尤其对药物的分析有着特有的贡献。头孢类抗生素作为抗生素的重要分支，一直以来是药物分析的重点和热点之一。本文选取十种头孢类抗生素或前体为供试样品，以CZE模式，检测波长为195nm，缓冲液为40mmol/L磷酸盐(Na2HPO4+NaH2PO4，pH为7.0)，总柱长为65cm，有效柱长为45cm，柱内径50μm，分离电压为-15kV，重力进样，以此建立了一种高效毛细管电泳的分析方法并对其进行了方法学验证。该方法表明，十种供试样品可在20分钟内实现基线分离。本方法简单有效，为头孢类抗生素类抗生素的分离分析提供了一种新的借鉴模式。
【关键词】毛细管电泳，头孢类抗生素，方法开发
毛细管电泳，又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是八十年代问世的一种高效的液相分离方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，它已成为分析化学新兴的一个分支学科[1]。毛细管电泳具有分析时间短，分离效率高，溶剂消耗少的特点。柱的效率通常达到105～107理论塔板/米。毛细管电泳有六种不同的分离形式：毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱(MEKC)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管快速电泳(CITF)以及毛细管电色谱(CEC)模式等。CZE是毛细管电泳中使用最广泛，最基本的分离方式。其应用包括无机离子，小分子氨基酸、多肽以及蛋白质等物质。此外，通过向缓冲溶液中加入手性添加剂，一些对映体也能够被分离。头孢菌素类抗生素的pKa一般在2～5，当缓冲溶液的pH值大于5时，这些头孢菌素类抗生素化合物将带负电。因此，头孢类抗生素可以通过高效毛细管电泳来分离。本实验选取十种头孢类抗生素或前体作为供试样品，通过对毛细管电泳条件的优化，建立了分析头孢菌素抗生素的高效毛细管电泳的分离方法并对其进行了方法学验证。
1 仪器与试剂
1.1仪器
CE：型号CE-1000，UnimicroTechnologies生产。pH计：型号PB-10，北京赛多利斯仪器有限公司生产。超声波清洗器：型号KQ2200B，昆山超声仪器有限公司生产。电子天平：型号FA1004，上海恒平科学仪器有限公司生产。紫外分光光度计：型号LAMBDA25，PekinElmer生产
1.2试剂
纯化水：UnimicroTechnologies临用新制。甲醇：级别HPLC，SCRC生产。Na2HPO4：级别AR，SCRC生产。NaH2PO4：级别AR，SCRC生产。乙腈：级别HPLC，Merck生产。
1.3实验对照品
所有实验对照品均来自于中国食品药品检定研究院，开瓶有效期均为2018年12月10日，所有对照品均为2～8℃保存。头孢克肟(含量：100%，批号：130503-201706)头孢氨苄(含量：100%，批号：130408-201411)，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(含量：100%，批号：130416-201006)，头孢呋辛(含量：100%，批号：130493-201706)，7-氨基头孢烷酸(含量：100%，批号：130538-200902)，头孢哌酮(含量：93.8%，批号：130420-201105，头孢他啶(含量：100%，批号：130484-201205)，头孢吡肟(含量：100%，批号：130524-201404)，头孢噻肟(含量：92.2%，批号：130483-201505)，头孢拉定(含量：88.4%，批号：130427-201708)。
2 头孢类抗生素的高效毛细管电泳分离方法的建立
2.1检测波长的选择
取实验对照品，分别配制成含各成分均约10μg/mL的紫外扫描溶液，分别于190～500nm下做紫外扫描，得出全波长扫描图谱。依照毛细管电泳波长选择的原则，在基质不干扰的情况下取最大灵敏度的波长，故选择195nm为测试波长。
2.2缓冲液的选择
根据各化合物的理化性质，头孢拉定pKa1(2.63)，头孢氨苄的pKa1=5.2以及其他的化合物的总pKa值范围在1.62～5.2，并存在一定的梯度。从pKa与pH的关系考虑，若化合物能得到良好的分离，即是说明pH至少为6.8以上。磷酸盐缓冲6.2～8.2，故选择磷酸盐缓冲液。缓冲液以Na2HPO4+NaH2PO4配制方式最容易重现。电渗流从pH=8开始下降。此时会使分析时间加长。再者头孢类在碱性条件中的稳定性不佳，故pH选择范围初步设定为6.8～8。实验结果显示，pH=7.0时分离效果最好。
2.3缓冲液浓度的选择
缓冲液浓度对峰形和出峰时间有较大影响。选择磷酸盐缓冲液浓度分别为30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L对方法进行考察。选择40mmol/L的浓度，因其可以达到更为理想的分离度，且分离时间在20min以内。
2.4毛细管长及内径
为调整分离度增加柱长是有限度的。本次实验选择三个柱长，分别是柱长1：总长为70cm(其中有效长度为50cm)，柱长2：总长为=65cm(其中有效长度为50cm)，柱长3：总长为65cm(其中有效长度为45cm)。其中柱长3能达到更加理想的分离度，效果明显好于其他柱长。
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不同内径大小的毛细管会对分析物的分离产生一定的影响，本实验分别考察50μm和75μm的毛细管柱。实验结果表明，内径为50μm的毛细管的柱效要比内径为75μm的高，供试样品能够在在20分钟以内得到基线分离，因此，我们选取50μm内径的毛细管。
2.5电压的选择
在一定范围内，增加分离电压可以改善相邻组分间的分离，而焦耳热限制了过高电压的使用。这里考察-15kV和-20kV的电压。-15kV耗能少，操作安全，焦耳热明显少于-20kV。
故综合2.1～2.5，最优化的分离条件是在CZE模式下，检测波长195nm，缓冲液为40mmol/L磷酸盐(Na2HPO4+NaH2PO4)，pH7.0，柱长65cm(其中有效柱长为45cm)，柱内径50μm，分离电压-15kV。分离效果见图1。
3 头孢类抗生素的高效毛细管电泳分离方法的验证
3.1线性
配制10种头孢类抗生素对照品混合储备溶液，使其浓度分别为100.0µg/mL。取该溶液逐步稀释，稀释最终线性浓度为六个级别：化合物LOQ，浓度1:3.0µg/mL，浓度2:4.0µg/mL，浓度3:5.0µg/mL，浓度4:10.0µg/mL，浓度5:20.0µg/mL。
在经优化的色谱条件下进行测试，得到一系列响应的数据，绘制校准曲线，得出线性回归方程和检测限。见表1。
3.2精密度实验取
3.1中的浓度3(5.0µg/mL)溶液，重复进样6针，考察各化合物的峰面积及迁移时间RSD。
峰面积RSD结果：头孢克肟、头孢氨苄、7-ADCA、头孢呋辛、7-ACA、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢拉定依次分别为8.60%、7.60%、6.50%、5.90%、9.70%、6.30%、7.30%、6.80%、5.40%、7.30%。
迁移时间RSD结果：头孢克肟、头孢氨苄、7-ADCA、头孢呋辛、7-ACA、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢拉定依次分别为2.60%、2.40%、1.20%、2.50%、2.30%、2.00%、2.60%、2.80%、2.60%、2.70%。
结果显示，所有化合物的峰面积RSD在5.4%～9.7%，迁移时间的RSD在1.2%～2.8%。说明该方法完全满足CE方法验证的要求，即迁移时间RSD小于3%，峰面积RSD小于10%。
4 结 论
本文在仔细研究了十种目标物的理化性质后，确认了毛细管电泳可分离分析十种头孢类抗生素，并随即成功开发了一套耗时短、操作方便快捷、经济环保的头孢类抗生素的分析方法并成功验证。该方法分离时间短且峰形良好，各组分能够被基线分离。方法验证结果说明，各组分线性良好，相关系数(r)均大于0.990;在平行进样六针下，迁移时间的RSD均小于3.0%，峰面积的RSD均小于10%。此外，该方法的检测限和定量限也满足样品检测的需求。
