摘要：体外纤维重组是天然胶原的重要分子行为，直接影响胶原的性能和应用。本研究以草鱼胶原为研究对象，系统观察了体系温度、pH、离子强度和时间等环境因素对重组胶原纤维形貌和粒径分布的影响。在此基础上，进一步比较了不同环境因子调控下，胶原重组纤维产物的耐酶降解性能和热稳定性能。结果表明，重组胶原纤维粒径和粒径分布受环境因子的调控。中性pH环境下胶原纤维粒径大但分布不均一，体系温度越高、离子强度越大，重组纤维粒径越小，延长纤维重组时间有利于纤维粒径的增大。纤维产物性能分析结果表明，纤维粒径越大，则胶原重组纤维产物的耐酶降解性能和热稳定性能越好。
关键词：草鱼;胶原纤维;环境因子;调控;形貌;性能
1引言
胶原是动物体内含量最丰富、分布最广泛的结构类蛋白之一[1，2]。由于具有独特的三螺旋分子构造、优异的生物相容性和机械力学性能，天然胶原在生物医学材料、医学组织工程、食品添加剂等领域中的应用日益广泛[3-5]。在现代生物医学领域，天然胶原作为优良细胞亲和材料[6]，用于组织再生工程的基质材料[7]、烧烫伤的创面促愈合敷料、靶向药物的生物载体等[8，9];在食品加工领域，胶原及其衍生物则广泛用于食品增稠和调质添加剂[10，11]。传统的商品化胶原主要来自于哺乳动物的皮肤或结缔组织，但由于存在人畜共患疾病的潜在风险，这类胶原在直接用于临床医学类产品时往往受到生物安全性方面的质疑[12，13]。近年来，水产加工废弃物(鱼皮、鱼骨)中的天然胶原，由于具有来源广泛、成本低廉、生物安全性更高等优势而逐步受到业内关注，相关研究成果不断积累，为水产胶原的开发应用提供了理论基础[14]。
相关期刊推荐：《武汉轻工大学学报》Journal of Wuhan Polytechnic University(季刊)曾用刊名：武汉粮食工业学院学报&武汉食品工业学院学报;武汉工业学院学报，1982年创刊，为理工科综合性学术期刊，国内外公开发行。主要报道国内外有关学科领域的科研成果、学术动态、向读者提供最新的科技信息。刊登食品科学与工程、生物工程、化学工程、土木工程、机械及其自动化设计制造、计算机科学与技术、电气工程、自动控制等学科的学术论文。读者对象为高校师生，相关学科专业、行业的工程技术或管理工作者。
纤维重组(自组装)，是天然胶原的独特分子行为。在体内，胶原分子以有序的排列方式，形成胶原微纤维、纤维和纤维束，构成了生物机体的皮肤、跟腱等器官的基质组分，并为机体器官提供必要的机械力学性能和生物稳定性能[15]。研究发现，在合适的体系环境下，天然胶原也可以通过自组装形成胶原纤维，其构造与体内胶原纤维相似。在胶原的生物医学应用中，通过胶原的体外纤维重组，可以大幅度改善胶原产品的理化性能(热稳定性、机械力学性能等)，从而实现材料性能的可控调节。
笔者的前期研究表明[16，17]，与哺乳动物胶原一致，鱼源胶原也可以通过调控合适的体系环境，实现体外纤维化重组，其纤维化重组的速度、程度受温度、pH、时间和离子强度等环境因子影响。但是，上述环境因子对胶原纤维化重组产物的微观形貌以及理化性能的影响，尚缺乏足够的认知。为此，本研究选择草鱼鱼皮胶原为研究对象，通过调控不同的环境因子，获取纤维化产物，表征其微观形貌和构造，开展差异化分析，探查不同环境因子对胶原纤维化产物形貌构造的影响及其规律。在此基础上，进一步对胶原纤维化产物的耐酶降解性、热稳定性开展系统分析，明晰环境因子调控对胶原纤维化产物理化性能的影响及其与纤维微观构造的关联性，为鱼源胶原在生物医学材料中的应用提供基础性数据和支撑。
2材料与方法
2.1实验原料
选择长江流域中常见的草鱼(Ctenopharyng-odonidellus)作为鱼源胶原蛋白的提取原料。新鲜的草鱼购自于武汉市常青花园超市，采用人工方法剥离鱼皮，细致剔除鱼皮上附着的肌肉等组织后反复洗涤，切成5×5cm小片，低温风干后冻藏备用。
2.2实验试剂与仪器
Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、CH3COOH、HCl等试剂均为分析纯(国药集团);羟脯氨酸标准品(≥99%)上海康达氨基酸厂;胃蛋白酶(800～2500U/mg)购置于丰达生物科技有限公司。
J-810圆二色谱仪(美国JASCO公司);LGJ-10D冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂);Q2000差示扫描量热仪(美国TA公司)。
2.3实验方法
2.3.1胶原的提取、纯化与结构表征
胶原的提取与纯化[18，19]：所有的提取和纯化操作均在环境温度低于10℃的条件下完成。鱼皮原料依次用无水乙醚、10%正丁醇溶液浸泡24h脱脂后用去离子水反复洗涤，沥干，随后用0.1mol/LNaOH溶液浸泡48h脱除杂蛋白，去离子水洗涤、沥干后用含2%胃蛋白酶的0.5mol/L乙酸溶液摇浴24h，分离上清液得到酶溶胶原(Pepsin-solu-bilisedcollagen，PSC)粗提液。向PSC粗提液中添加NaCl至0.9mol/L，4℃盐析24h后过滤。所获胶原蛋白沉淀用0.5mol/L乙酸溶液复溶，离心10min(10000r/min，)，上清液再次盐析、乙酸复溶3次，得到的离心上清液依次对0.1mol/L的乙酸溶液及蒸馏水透析后冷冻干燥得到纯化的胶原样品。
SDS-PAGE分析[20]：用0.1mol/L乙酸溶液溶解胶原样品。溶解后的样品溶液与0.5MTris-HCl缓冲液(pH=6.8，含有5%SDS和20%甘油)按照1：20混合，上样。凝胶电泳分离后，用考马斯亮蓝R-250染色。
圆二色谱分析[21]：胶原样品用0.1mol/L乙酸配置成0.1mg/mL溶液，圆二色谱测定条件为：光径1mm，波长扫描范围190-250nm，扫描精度0.5nm，测定温度为15℃。2.3.2不同环境因子调控下的胶原体外纤维重组
(1)pH调控：用0.5mol/L的乙酸配置浓度为3mg/mL的胶原溶液，取10mL置于透析袋中，分别在pH值为5、6、7、8、9的PBS溶液(含150mmol/L的NaCl)中透析至平衡。透析完成后于20000r/min条件下离心脱气处理10min后置于30℃水浴中启动天然胶原的体外纤维重组进程，重组时间为6h。
(2)纤维重组时间调控：用0.5mol/L的乙酸配置浓度为3mg/mL的胶原溶液，取10mL置于透析袋中，在pH值为7的PBS溶液(含150mmol/L的NaCl)中透析至平衡。透析完成后于20000r/min条件下离心脱气处理10min后置于30℃水浴中启动天然胶原的体外纤维重组进程，控制纤维重组时间分别为3、6、12和24h。
(3)温度调控：用0.5mol/L的乙酸配置浓度为3mg/mL的胶原溶液，取10mL置于透析袋中，在pH值为7的PBS溶液中(含150mmol/L的NaCl)透析至平衡。透析完成后于20000r/min条件下离心脱气处理10min后，分别置于20、25和30℃水浴中启动天然胶原的体外纤维重组进程，控制纤维重组时间为6h。
(4)离子强度调控：用0.5mol/L的乙酸配置浓度为3mg/mL的胶原溶液，取10mL置于透析袋中，在pH值为7的PBS溶液中，通过控制PBS溶液中NaCl浓度分别为0、50、100、150和300mmol/L，调控体系离子强度，透析至平衡。透析完成后于20000r/min条件下离心脱气处理10min后，置于30℃水浴中启动天然胶原的体外纤维重组进程，控制纤维重组时间为6h。
2.3.3胶原体外重组纤维的微观形貌观测与分析
(1)重组纤维的分离和前处理：对体外纤维重组后的胶原溶液进行低温离心处理(20000r/min，10min)，弃去上清液后用PBS缓冲液清洗胶原纤维沉淀并再次离心(重复3次)，得到的胶原纤维沉淀用含有2%戊二醛的PBS溶液固定10h(4℃)，固定样品用PBS洗涤后进行梯度脱水(30%、50%、70%、90%、100%的乙醇)，随后用乙醇/乙酸异戊酯混合溶液(1：1)浸泡两次，每次5～10min，最后用纯的乙酸异戊酯浸泡两次，每次5～10min。
(2)SEM观测：处理好的胶原纤维胶用二氧化碳临界点干燥法进行干燥。然后按照扫描电镜的方法进行取样、喷金和观测。
(3)纤维粒径的测量与统计：用直线绘制方法通过NanoMeasurer软件测量SEM图片中纤维的直径。一个样品选取不同区域的3张图片，共测量150根纤维，得到纤维的平均直径，计算平均偏差和标准偏差。
2.3.4胶原体外重组纤维的性能分析
采用低温离心方法分离不同环境因子调控下的草鱼胶原纤维重组产物，冷冻干燥，得到纤维重组固形物，用于性能分析和测试。
(1)体外酶降解性能：取20mg冻干样品置入10mL的离心管中，加入7mL的Tris-HCl溶液(0.01mol/LTris-HCl，pH=7.4含0.8mmol/LNaN3、5mmol/LCaCl2)，随后加入2mL胶原蛋白酶溶液(0.5mg/mL，活力单位：268U)，30℃降解12h。取适量酶解液，20000rpm/min离心5min，取4mL的上清液，测其中羟脯氨酸的含量;取10mg的样品加浓盐酸水解后测其总羟脯氨酸的含量。两者的比值即为降解率，降解率越高，反映胶原的耐酶降解性能越弱。羟脯氨酸含量参照Reddy等人的方法[22]来测定，以未组装的PSC做对照。
(2)热稳定性能：参照Nalinanon等人的方法[23]，准确称取20mg组装样品于1.5mL离心管中，注入0.4mL蒸馏水浸泡20min左右后吸掉水分，以洗涤盐离子，重复操作2～3次。然后加入0.4mL蒸馏水，低温(4℃)充分溶胀3-4天(1：40w/v)，用差式扫描量热仪DSC-Q10测定样品变性温度。仪器采用金属铟进行校正(铟的熔融焓为28.451J/g，熔点为165.4℃)。样品从20℃加热到60℃，升温速率为2℃/min，样品室的氮气流量为50ml/min，以空铝盒做对照，根据DSC曲线中得到样品热变性温度(Td)的相关信息，以未组装的PSC作为对照。
(3)溶胀性能：准确称取20mg样品，置于温度为25℃的蒸馏水中溶胀6h，取出置于培养皿中滤干10min，然后精确称量溶胀后的样品质量，每个样品做5个平行样。
3结果与讨论
3.1草鱼胶原的结构鉴定
实验提取并分离纯化后得到的草鱼胶原蛋白为白色多孔的海绵状结构，胶原样品经SDS-PAGE凝胶电泳分析，表明蛋白样品由两条α1和一条α2肽链条带组成，无其他杂蛋白条带存在，说明所得胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原(图1a)。圆二色谱波长扫描分析结果(图1b)显示，该胶原样品在220nm和195～200nm处各有一最大的正吸收峰和负吸收峰，为典型的胶原三螺旋色谱峰形特征。圆二色谱波长温度扫描分析结果表明(图1c)，随着扫描温度的提升，胶原样品220nm吸收值呈现典型的反S状曲线，与胶原三螺旋结构解离导致的220nm吸收骤降规律一致，进一步证实该胶原具有完整的三螺旋构造。
3.2环境因子对胶原体外重组纤维形态的调控作用
3.2.1pH值的影响
不同pH体系条件下胶原纤维重组产物的SEM形貌图和纤维粒径统计图如图2所示。SEM形貌图清晰的显示出胶原重组后形成的纤维形态，大量纤维交错堆积，形成纤维网络结构，纤维没有明显的取向性。粒径统计的结果表明，当组装体系pH接近中性条件时(pH=6、7)，组装产物的纤维粒径达到最大(153.4±63.5nm和150.9±79.1nm)且显著大于其他pH条件下的重组纤维粒径(p<0.05)，降低或升高体系pH均会导致其产物粒径的降低。但是，从纤维粒径的统计分布图中可以观察到，在中性pH条件时，其产物粒径的分布不均匀性也最大，而在弱酸性或弱碱性条件下组装产物的粒径分布均匀性明显提高。推测这可能是因为在中性条件下所有胶原分子间相互作用最为强烈，纤维化程度最高，但与之相伴随的是分子间相互作用的随机性也随之增加，从而容易形成大小不一的粒径形态;而在弱酸性或弱碱性条件下，氢键、离子键作用增强，但电荷排斥作用对胶原分子有序聚集和排列产生抑制效果，只有部分定位准确的胶原分子参与组装并形成相对均一的粒径分布。
