摘 要 对 8 株分离自广州市售海产品中的副溶血弧菌菌株进行鉴定，并分析了其耐药性。于 2017 年 4 ～ 5 月采集市售海产品，按照国标法对其中的副溶血弧菌进行分离鉴定，并进行 16S rDNA 同源性比较。采用 K-B 纸片法和结晶紫染色法分别评估了副溶血弧菌菌株对 20 种常见抗生素的药物敏感性及其生物膜形成能力。结果表明，8 株分离菌株对多粘菌素 B、头孢他啶、庆大霉素、强力霉素、氯霉素、红霉素、环丙沙星、萘啶酸这 8 种抗生素均为敏感，对青霉素、万古霉素 2 种抗生素均显示耐药，对其他 10 种抗生素有不同程度的耐药性。相比 ATCC 17802 菌株，分离菌株多重耐药性更为显著，耐抗生素数量为 3 ～ 10 种。分析菌株的生物膜形成能力，发现其耐药性与生物膜形成能力呈正相关。海产品中副溶血弧菌耐药性普遍且多重耐药性显著的现象，应该予以广泛关注和重视。
关键词 海产品; 副溶血弧菌; 鉴定; 耐药性; 生物膜
副溶血弧菌是一种常见的嗜盐性革兰氏阴性菌，适宜生长 2. 5% ～ 3% 的盐溶液中，主要分布于海水及鱼、虾、蟹、贝等海产食品中，是引起海鲜类食物中毒的主要原因[1 - 3]。据报道，在亚洲，尤其是在中国、日本、韩国，因为生吃海鲜而引起的副溶血弧菌食物中毒事件频频发生[4 - 5]。2003 - 2005 年广东省水产品污染状况调查显示，431 份样品中有 156 份检出副溶血性弧菌，总检出率为 36. 19%[6]。2008 年上海的调查数据显示，副溶血弧菌是导致夏秋季腹泻的主因，门诊腹泻患者肛拭检测副溶血性弧菌阳性率为 2. 95% ，远高于沙门菌( 0. 53% ) ，位居首位[7]。2016 年唐山市调查显示，采集的 204 份海产品中，副溶血性弧菌阳性检出率为 32. 84%[8]。副溶血弧菌携带 tdh、trh 毒力基因，人感染后会导致急性肠胃炎，临床症状为腹泻、头痛、呕吐、恶心、低烧[9]。
由于抗生素的长期、不合理使用以及缺乏有效监管，病原菌的耐药性越来越强，且出现多重耐药性问题。近年来，多种“超级细菌”不断被发现，引起了国内外的广泛关注[10]。2010 年 8 月《柳叶刀》报道了英国卡迪夫大学医学院蒂莫西教授发现的携带新德里一号金属酶( NDM-1) 基因的细菌，这是继 MRSA 之后发现的又一超级耐药细菌[11]。耐药感染性疾病已成为当前临床感染性疾病死亡的主要原因[12]。海产养殖过程中抗生素的滥用也导致了副溶血弧菌耐药性的增强，使得抗生素的药敏性大大下降甚至消失，从而导致临床治疗副溶血弧菌感染病症难度变大，成本增加。
生物膜( biofilm) 是单一或混合的微生物聚集、附着于物体表面上生长繁殖，并包被在自身分泌的胞外聚合物中而形成的类膜结构的聚合体[13 - 14]。生物膜能够使细菌免受宿主的获得性免疫应答以及吞噬细胞的捕食，使其耐药性提高 10 ～ 1 000 倍[15]。本研究对广州市售海产品中的副溶血弧菌进行分离鉴定，并分析了其耐药性及生物膜形成能力，旨在为海产品的质量安全控制以及防治副溶血弧菌感染提供理论依据和参考数据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 标准菌株与材料
副 溶 血 弧 菌 ( Vibrio parahaemolyticus ) ATCC 17802、大肠杆菌( Escherichia coli) ATCC 25922 由本实验室保藏。鱼、虾、蛤、蚝等海产品采集于广州市区超市及农贸市场。氧化酶试纸、副溶血弧菌生化检测试剂盒购于广东环凯微生物科技有限公司。细菌基因组 DNA 提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。
1. 1. 2 药敏纸片
20 种常用抗生素的药敏检测纸片，包括青霉素 ( PEN，10 μg) 、氨苄西林( AMP，10 μg) 、氨苄西林/舒巴坦( AMS，10 μg) 、美罗培南( MEM，10 μg) 、多粘菌素 B( PB，300 μg) 、万古霉素( VAN，30 μg) 、头孢噻吩( CEP，30 μg) 、头孢他啶( CAZ，30 μg) 、庆大霉素 ( GEN，10 μg ) 、卡 那 霉 素 ( KAN，30 μg ) 、链 霉 素 ( STR，10 μg ) 、四 环 素 ( TET，30 μg ) 、强 力 霉 素 ( DOX，30 μg) 、氯霉素( CHL，30 μg) 、乙酰螺旋霉素 ( ASP，30 μg) 、红霉素( ERY，15 μg) 、环丙沙星( CIP， 5 μg) 、萘啶酸( NA，30 μg) 、利福平( RIF，5 μg) 、复方新诺明( SXT，23. 75 /1. 25 μg) ，购于杭州市微生物试剂有限公司。
1. 1. 3 溶液及培养基
质量浓度为 1 g /L 结晶紫溶液; 体积分数为 33% 冰乙酸溶液: 量取 100 mL 冰乙酸，加入到 200 mL 去离子水中。
含质量浓度为30 g /L NaCl 的胰蛋白胨大豆肉汤培养基( TSB) : 胰蛋白胨 15 g、大豆蛋白胨 5 g、NaCl 30 g、去离子水 1 L。用 1 mol /L NaOH 溶液调节 pH 为 7. 0 ～ 7. 4; 121 ℃，0. 15 MPa 下高压灭菌 15 min。
含 30 g /L NaCl 的胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基( TSA) : 在上述 TSB 配方的基础上加入1. 5% 的琼脂，加热融化后灭菌。
含 30 g /L NaCl 的碱性蛋白胨水、TCBS 培养基、 3% 氯化钠三糖铁琼脂、MR-VP 培养基、MHB 培养基均购于广东环凯微生物微生物科技有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 样品采集及处理
从广州市各区的 14 个超市及农贸市场采集市售的鱼、虾、蛤、蚝等海产品，用无菌采样袋装好后放入冰盒装中返校，确保在 2 h 内处理样品。鱼取表面组织、腮、肠; 虾( 甲壳类) 用自来水洗净后取整个动物，包括肠和腮; 蛤和蚝( 贝类) 用自来水冲洗干净后取内容物。取样时均为无菌操作方式。
1. 2. 2 副溶血弧菌的分离鉴定
菌株分离鉴定: 按照 GB 4789. 7—2013 中副溶血弧菌检验方法，样品在质量浓度为 30 g /L 氯化钠碱性蛋白胨水中增菌后，划线分离于 TCBS 平板中，挑取可疑单菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验、3% 氯化钠三糖铁琼脂试验、嗜盐性试验，并利用副溶血弧菌生化检测试剂盒进行生化鉴定，包括 30 g /L 氯化钠甘露醇、3% 氯化钠赖氨酸脱羧酶、ONPG 和 MR- VP 试验。
16S rDNA 测序: 生化试验阳性菌株进行 16S rDNA 同源性比较分析。菌株在 TSB 培养液中培养过夜后，用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，于 - 20 ℃中保存备用。基因组 DNA 进行 PCR扩增，所用引物为 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1495R: 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA- 3’。扩增体系为: 无菌水 10. 5 μL，混合引物 1 μL， taq PCR Master Mix 12. 5 μL，DNA 模板 1 μL。其中混合引物为 1 μL 27f、1 μL 1492r 和 8 μL 无菌水。 PCR 反应条件: 95 ℃预变性 5 min( 95 ℃ 变性 1 min， 54 ℃复性 1 min，72 ℃ 延伸 2 min) ，30 个循环，72 ℃ 保温 10 min。扩增后的 DNA 经检验送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将 16S rDNA 基因测序结果通过 BLAST 在 GenBank 中进行同源比对分析。
1. 2. 3 菌株的耐药性分析
将副溶血弧菌分离菌株、ATCC 17802 菌株和质控菌株大肠埃希菌 ATCC 25922 分别接种于 TSB 和 LB 培养基中，于 120 r/min 的摇床内 37 ℃活化 12 h。培养液于 4 000 r/min 离心 10 min，收集菌体，用生理盐水 10 倍稀释至浓度为 108 CFU/mL。
取 100 μL 菌液在 MH 琼脂平板中，涂布均匀。干燥数分钟后，用无菌镊子夹取 20 种常用抗生素纸片轻轻放置在平板中，纸片间距不小于 24 mm，距离平板边缘不小于 15 mm。平行实验 3 次。将平板倒置于培养箱中，37 ℃下培养18 h 后，用标准直尺测量抑菌圈大小，根据参照美国临床实验室标准化协会 ( Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 抗菌药物敏感性试验执行标准推荐的纸片扩散法及判定标准[16]、杭州微生物试剂有限公司提供的产品说明书整理出的标准( 表 1) 判定结果。
1. 2. 4 结晶紫染色法测定生物膜形成量
将副溶血弧菌 TSB 培养液离心后收集菌体用 TSB 培养基 10 倍稀释至浓度为 106 CFU/mL; 分别在 96 孔板中每孔加入 200 μL 菌液; 封盖后用保鲜膜包好，在 37 ℃下静置培养 24 h; 将孔板中的培养液去除，使用多道移液枪在每孔中加入 250 μL 无菌生理盐水清洗 3 遍，去除浮游菌; 60 ℃ 干燥 15 min; 在干燥后的孔板中加入 200 μL 质量浓度为 1 g /L 的结晶紫溶液，染色 10 min; 弃去结晶紫溶液，使用无菌生理盐水清洗 3 遍，继续干燥 15 min; 在每孔中加入 200 μL、33% 冰乙酸，静置 10 min 后，使用 Multiskan FC 酶标仪( Thermo，USA) 测量 OD595值[17]。
2 结果与分析
2. 1 海产中副溶血弧菌的分离鉴定
从广州市区的超市及农贸市场采集市售海产品，随即进行样品处理，增菌 18 h 后进行 TCBS 平板划线分离、革兰氏染色镜检、氧化酶试验、质量浓度为 30 g /L 的氯化钠三糖铁试验、嗜盐性试验。结果表明，分离菌株在 TCBS 培养基中菌落为绿色( 图 1) ，镜检为短弧状的杆菌( 图 2) 。
氧化酶试验呈阳性，具有嗜盐性。对 8 株菌株进行生理生化实验和 16S rDNA 同源性比较，鉴定为副溶血弧菌菌株( 表 2) 。
2. 2 分离菌株的耐药性分析
测定副溶血弧菌分离菌株和 ATCC 17802 菌株对常用 20 种抗生素的药敏结果如表 3、图 3 所示。结果表明，8 株分离菌株对青霉素类、β-内酰胺类、青霉烯类的抗生素抗性很强，对氨基糖苷类、四环素类、苯丙醇类、大环内酯类、喹诺酮类、安莎霉素类、叶酸代谢途径抑制剂等抗生素较为敏感。其中对青霉素、万古霉素 2 种抗生素均显示耐药性; 对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢噻吩耐药的菌株也达到 7 株，对红霉素、环丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感，对卡那霉素、氯霉素、四环素、强力霉素、复方新诺明具有耐药性的菌株比较少，有 1 ～ 2 株，说明这些抗生素表现出对副溶血弧菌分离菌株较强的抑制作用。此外，只有 8 号菌株的耐药性弱于 ATCC 17802 菌株，大部分分离菌株耐抗生素的种类更多。
2. 3 菌株的多重耐药性分析
通过分析发现，所有菌株都存在多重耐药性，且耐抗生素种类都在 3 ～ 10 种，多重耐药性主要发生于青霉素类、β - 内酰胺类、青霉烯类之间( 图4) 。由此可见副溶血弧菌分离菌株多重耐药性很强。同时， ATCC 17802 菌株也具有多重耐药性，耐抗生素种类为 5 种。其中来源于鲈鱼、虾体内的分离菌株多重耐药性很强，2 号菌株耐药性最强，耐抗生素种类高达 10 种，1、4、5、7 号菌株耐抗生素8 种以上，均比 ATCC 17802 菌株多。仅有来源于蛤的 8 号菌株耐 3 种抗生素，多重耐药性相对 ATCC 17802 菌株较弱。在对多重耐药谱分析中发现，来源于虾体内的 4、5 号菌株耐抗生素都是 8 种，且两者只有 1 种抗生素差别; 来源于鱼的 1、2、6、7 号菌株的多重耐药无论数量还是种数差异都比较大( 表 4) 。
3 结论与讨论
3. 1 菌株耐药性差异分析
副溶血弧菌耐药性具有时空特性，不同地区的菌株具有不同的耐药性。这是由于每个地区使用抗生素种类、剂量和菌群特异性导致的。本研究的结果表明，市售海产品中 8 株副溶血弧菌分离菌株对青霉素、万古霉素 2 种抗生素显示完全耐药; 对美罗培南、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢噻吩、利福平这 5 种抗生素具有非常普遍的耐药性，耐药菌株在 5 株以上; 对卡那霉素、氯霉素、四环素、强力霉素、复方新诺明 5 种抗生素耐药性很低，对多粘菌素 B、头孢他啶、庆大霉素、氯霉素、红霉素、环丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感。同为广州市海产品中副溶血弧菌分离菌株，冼钰茵等[18]的研究表明，其对万古霉素、氨苄西林、链霉素的耐药率分别 为 100% 、77. 01% 和 85. 06% ，对利福平、庆大霉素、红霉素、头孢噻吩、四环素、复方新诺明、环丙沙星的耐药率在 5% 及以下。这与本实验结果具有比较高的一致性，但又在头孢噻吩、利福平这 2 种抗生素上存在区别。说明同地区的副溶血弧菌耐药性也不尽相同。而由于不同地区抗生素使用数量和剂量的差别、菌群差别，在国内的其他地区或国外地区，副溶血弧菌耐药性差异更大。卢奕等[19]研究表明，上海市水产品中副溶血弧菌对卡那霉素、多粘菌素 B、环丙沙星的耐药性很高，对氨苄西林/舒巴坦、头孢噻吩、万古霉素、利福平的耐药性非常低，这与本实验的结果不同。分离菌株对同一类抗生素的耐药性不同。如万古霉素和多粘菌素 B 都是糖肽类抗生素，头孢噻吩和头孢他啶都是头孢类抗生素，由于前者是第一代药物，后者是第三代药物，副溶血弧菌对前者耐药性明显比后者强。不同来源的副溶血弧菌菌株的耐药性也不同，本研究发现，来源于鱼和虾的 7 株菌多重耐药性强，耐抗生素种类为 5 ～ 10 种。相比较而言，来源于蛤的 8 号菌株，多重耐药性较弱，耐抗生素为 3 种。
3. 2 细菌生物膜与耐药性
细菌生物膜是细菌生存的一种重要机制，它增强了细菌对不良环境的耐受力，尤其是耐药性。生物膜阻碍隔绝抗生素的进入，同时为膜内细胞的生存及相互交流提供稳定环境[20 - 21]。同时，生物膜外排泵系统[22]、特定基因变化引起的应激反 应[23]、群 体 感应[24]、膜内细菌代谢活性下降[25]也是其耐药机制。本研究分析副溶血弧菌药敏实验结果及其生物膜形成能力发现，两者之间存在正相关。其中，1、2、3、4、 5、7 号菌株生物膜形成能力比较强，其多重耐药性也非常显著，耐抗生素种类为 7 ～ 10 种; 6 号和 8 号菌株生物膜形成能力比较差，耐抗生素种类分别为 5 种和 3 种。与标准菌株 ATCC 17802 相比，6 号和 8 号菌株在形成生物膜能力差异相对小，其多重耐药性的差异也 不 大，而其他菌株生物膜形成能力极显著 ( p < 0. 01) 强于标准菌株，其多重耐药性也十分显著。有研究表明生物膜细菌对次氯酸的抗性比浮游菌强 15 ～ 3 000 倍[26]，致病性大肠杆菌对环丙沙星及氟苯 尼 考 的 耐 药 性 与 生 物 膜 形 成能力呈正相关[27]。
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