[摘要]目的：研究小叶女贞果实中山柰酚的酸水解提取条件，建立高效液相色谱法测定小叶女贞果实中的山柰酚含量的方法，并分析不同来源药材中山柰酚的含量差异。方法：小叶女贞果实经体积分数为20%的盐酸-甲醇溶液(1：4)水解提取后，用高效液相色谱法测定其水解液中的山柰酚的含量。以InertsilODS-SP(5μm，250×4.6mm)色谱柱，乙腈-0.3%磷酸水溶液(37：63)为流动相进行等度洗脱，流速为1.000ml/min，检测波长为370nm;柱温为35℃。结果：实验的方法学考察结果表明，山柰酚进样量在0.192～1.152μg范围内的峰面积与吸光度有良好线性关系，其回归方程为y=5E+06x+18.723，r=0.9998;平均回收率为98.64%(RSD%=1.89，n=6);在此测定条件下稳定性试验的RSD为1.52%，样品溶液在24h内稳定，重复性试验的RSD为1.42%，该测定方法的重现性较好;9批不同来源小叶女贞果实样品中山柰酚含量有一定差异，平均含量为0.3506mg/g，RSD为0.18%。结论：酸水解提取-高效液相色谱法可用于小叶女贞果实中山柰酚的含量测定。
[关键词]高效液相色谱法;小叶女贞果实;山柰酚;含量测定
小叶女贞(LigustrumquihoniCarr.)又名小叶冬青，在全国各地均有分布，资源丰富。其根叶可入药，具有清热解毒的功效，可治疗外伤、烫伤等症。经文献检索和资料查阅，该植物果实的药用未发现有文献记载。据文献报道小叶女贞中含有齐墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚及挥发油等化合物;其提取物具有免疫调节、止咳平喘及清除自由基的作用;山柰酚的抗菌、抗病毒、抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、对动脉粥样硬化及糖尿病的防治作用备受关注。小叶女贞果实中山柰酚至今尚未见有含量测定的报道。本实验建立了HPLC测定小叶女贞果实中山柰酚的方法，该方法简便易行、结果准确、重复性好。
1 实验材料
1.1 仪器
LC-20A色谱仪(岛津)，SPD-M20A二极管阵列检测器(岛津);MS105型分析天平(梅特勒-托得多仪器有限公司);K-Q500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TG16-WS台式高速离心机(郑州宏朗仪器设备有限公司);DZKW-4电子恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂)。
1.2 药品及试剂
山柰酚对照品(批号为ST0105，上海如吉生物科技);乙腈为色谱纯(德国默克公司)，其余所用试剂均为分析纯。
1.3 药材
药材9批，于冬至前采集，经天然药物教研室陆鸿奎副教授鉴定为木犀科女贞属植物小叶女贞(LigustrumquihoniCarr.)的果实。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取山柰酚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解制成每1ml含山柰酚0.0960mg的对照品溶液，即得。
2.2 供试品溶液制备
取药材样品粗粉(过2号筛)1g，精密称定，用石油醚50ml回流1小时，药渣挥干石油醚后，加入20%盐酸溶液15ml，乙酸乙酯60ml水浴回流提取1小时，滤过，滤液用40%氢氧化钠溶液调节pH5～6后于水浴浓缩至干。残渣用甲醇溶解，于15000r/min离心10min，定容为50ml，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作样品溶液。
2.3 色谱条件
用InertsilODS-SP(5μm，250×4.6mm)色谱柱，在370nm波长、35℃柱温条件下，进样10μl，流速为1.000ml/min，以乙腈-0.3%磷酸水溶液(37：63)为流动相进行洗脱。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取2.1和2.2项下制备的对照品和供试品溶液各10μl，按2.3色谱条件项下色谱条件进行测定，记录色谱图，色谱图见图1。结果，供试品中山柰酚色谱峰的保留时间为9.09与对照品溶液一致，分离度均大于1.5，理论塔板数不低于4000，溶剂空白无干扰。色谱图见图1。
2.5 线性关系考察
按2.3色谱条件项下方法，精密吸取2.1项下的对照品溶液1，2，3，4，5，6，12μl，分别注入液相色谱仪，测得山柰酚面积的回归方程为y=5E+06x+18.723，r=0.9998。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，在上述色谱条件下，山柰酚进样量在0.096～1.152μg范围内与峰面积的线性关系良好。山柰酚线性关系见图2。
2.6 精密度试验
分别吸取2.1项下的对照品溶液10μl，按2.3项下色谱条件测定6次，其峰面积RSD为1.63%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
取同一批药材(采于楚雄医专校园内的药材)，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8，12，24h进样10μl，测得山柰酚的峰面积RSD为1.52%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批药材粗粉(过2号筛)6份，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取各10μl注入高效液相色谱仪，按2.3项下色谱条件进行含量分析，山柰酚质量分数的RSD为1.42%，表明该测定方法的重复性良好。
2.9 加样回收率试验
取已知山柰酚含量的药材粗粉(过2号筛)6份，精密称定，每份约2g，分别加入山柰酚对照品适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，测得山柰酚的平均回收率为98.64%(n=6)，RSD=1.89，结果见表1。
2.10 样品测定
取药材样品粗粉(过2号筛)1g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μl，按2.3项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算山柰酚含量。同法测定9批样品(批号见表2)，每批样品平行测定三次，其测定结果的平均值见表2。
3 讨论
在提取条件的选择中，为药材中的山柰酚由苷水解为游离状态，常在提取溶剂中加入一定量的酸进行水解。笔者考察了甲醇-2%盐酸、乙醇-2%盐酸、乙酸乙酯-2%盐酸等为提取溶剂进行回流和超声提取，结果显示，以乙酸乙酯-2%盐酸(4：1)为溶剂进行超声提取效果最佳。洗脱剂的选择，考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸水溶液的等度和梯度洗脱的情况，最终选择用乙腈-0.3%磷酸(37：63)洗脱进行等度洗脱分离较好。用二极管阵列检测器对山柰酚用上述条件在波长200～400nm绘出3D图谱，结果山柰酚于370nm波长处的HPLC色谱响应较大，同时各色谱峰分离度较好，故选择370nm为检测波长。
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建立的方法稳定性、回收率、重复性和分离效果较好，能快速、准确地测定小叶女贞果实中山柰酚的含量，可用于小叶女贞果实中山柰酚的含量测定。
