摘要:目的建立同时测定玉叶解毒颗粒中绿原酸和槲皮素两种主要成分含量的HPLC方法。方法采用PhenomenonexGeminiC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～20min，80%A→55%A;30～45min，15%A→0%A)，流速1mL/min，检测波长为345nm。结果玉叶解毒颗粒中绿原酸、槲皮素的含量范围分别为:0.30～3.00μg/g，0.18～1.8μg/g，且线性关系良好;平均回收率分别为99.930%、95.005%，RSD均小于2.0%。结论该检测方法简便，可靠，稳定。经方法学验证，可用于同时检测玉叶解毒颗粒中绿原酸和槲皮素的含量。
关键词:玉叶解毒颗粒;绿原酸;槲皮素;HPLC
玉叶解毒颗粒收载于《卫生部药品标准》中药方剂第十八册，由玉叶金花、金银花，菊花等7种中药成分配伍而成，具有清热解毒，辛凉解表，生津利喉等功效[1～3]，用于防治外感风热引起的感冒，咳嗽，咽喉炎，尿路感染。目前，在该部颁标准中，有性状，鉴别，检查，醋酸乙酯浸出物的4项检查，而鉴别项下的检查只有针对积雪草对照药材和积雪草苷的薄层色谱鉴别，难以全面控制其内在质量。玉叶金花[4，5]，菊花[6]是玉叶解毒颗粒中的两个主要药味，其主要有效成分分别是绿原酸和槲皮素，绿原酸具有抗炎，降血压，抗糖尿病，抗菌等作用[7]，槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、心血管保护作用药理活性[8]，但在该标准中未见对此有效成分的鉴别和含量测定的检查，而现有文献也只是报道测定玉叶解毒颗粒中单一成分绿原酸的HPLC条件[9]，以及检测该颗粒剂中蒙花苷[10～12]的HPLC方法，未见有同时测定两种主要成分绿原酸和槲皮素的HPLC条件[13，14]的报道。本文建立了同时测定绿原酸和槲皮素两种成分的HPLC方法，可以更好的控制玉叶解毒颗粒制剂的质量，为评价和控制玉叶解毒颗粒的质量提供了科学依据，更为《中国药典》收载玉叶解毒颗粒的质量控制提供了一定的依据。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪(DAD检测器)，PhenomenonexGemini00G-4454-E0C18(250mm×4.6mm，5μm)，上海亚荣RE-2000A型旋转蒸发仪，予华DFY-5L/40型低温恒温反应浴，长城科工贸SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，上海科导SK2200H型超声波过滤器，梅特勒-托利多AB204-S型电子天平。
1.2试剂绿原酸对照品(批号110753-200212)，槲皮素对照品(批号100081-200907，含量97.4%)，均购于中国食品药品检定研究院;甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水。玉叶解毒颗粒(三金集团湖南三金制药有限责任公司，批号分别为170410，170204，170402，规格为12g/袋)。
2方法与结果
2.1混合对照品溶液的制备精密称取对照品绿原酸7.5mg，槲皮素4.5mg，分别置于25mL容量瓶中，加入70%甲醇，振摇使之溶解并定容至刻度，制得绿原酸0.30mg/mL，槲皮素0.18mg/mL两种对照品储备液。精密量取两种对照品溶液各17mL，混合均匀，制成混合对照品储备液。
2.2供试品溶液的制备精密称取玉叶解毒颗粒3.0000g，加入7mL甲醇，超声处理(功率90W，频率59kHz)30min，过滤，用5mL甲醇分两次清洗容器和药渣，洗液和药渣合并，减压浓缩，残渣用5mL甲醇溶解后转移至25mL容量瓶，加入甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液备用。
2.3色谱条件色谱柱:PhenomenonexGemini00G-4454-E0C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相:甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，80%A→55%B，30～45min，15%A→0%B)，流速1mL/min，柱温:常温(30℃)，进样量20μL，检测时间:45min。在上述色谱条件下对照品和供试品的色谱图见图1。
2.4线性关系的考察精密吸取“2.1”项下混合对照品储备溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分别置于10mL量瓶中，加100%甲醇至刻度，制成系列浓度混合对照品溶液，取上述对照品溶液各20μL注入液相色谱仪，按“2.3”色谱条件依次进样测定记录峰面积，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，绿原酸和槲皮素的回归方程、线性范围和相关系数见表1。
2.5精密度测试取供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。绿原酸和槲皮素峰面积的RSD分别为0.24%和1.80%，表明精密度良好。
2.6稳定性试验取同一供试品溶液(批号:170402)，按“2.1”项下供试品溶液的制备方法制备，按照“2.3”项下色谱条件，分别于制备后的0，2，4，6，8，10h进样20μL，分别记录绿原酸和槲皮素的峰面积，峰面积的RSD分别为1.60%和1.70%，表明玉叶解毒颗粒供试品溶液各组分在10h内稳定。
2.7重复性试验按照“2.2”项平行取6袋同一批次的玉叶解毒颗粒，分别制成供试品溶液，分别进样20μL，结果样品中绿原酸和槲皮素含量的平均值分别为0.4251mL/min，0.0114mL/min，RSD分别为1.42%，0.84%。
2.8回收率实验精密量取300μg/mL的玉叶解毒颗粒样品储备液6份，每份920μL，分别加入300μg/mL的绿原酸167μL、180μg/mL的槲皮素标准品48μL，得到6份供试品溶液，按照“2.3”所述色谱条件，平行进样6次，进行加样回收率实验:结果绿原酸和槲皮素的平均回收率分别为99.930%、95.005%，RSD分别为0.41%、1.00%。
2.9样品含量测定取3个批次的玉叶解毒颗粒，每批取3份，分别按照“2.2”项制备供试品，并按照“2.3”项所述色谱条件进样测定，以外标法计算含量，结果见表2。
3讨论
3.1样品预处理条件的优化供试品溶液制备方法分别考察了不同浓度(50%、70%、75%、100%)甲醇溶剂进行超声提取和常温振摇溶解对溶解率的影响。结果显示，75%甲醇水溶液超声提取5min效果最好。超声5min以上时，溶解率基本不变，故选择75%甲醇水溶液辅助超声波溶解5min提取法制备供试品溶液。
3.2检测波长的选择本实验考察了波长的影响，使用二极管阵列检测器，对三种供试品溶液在190～400nm波长范围内进行全波长扫描，槲皮素在350nm处有最大吸收，绿原酸在328nm处有最大吸收，对比扫描结果，为了使各成分都得到较好的响应，并且考虑检测灵敏度、基线飘移情况及兼顾实验的易操作性，综合上述，最终选择了345nm作为检测波长，在此波长下，绿原酸和槲皮素均有较高强度的吸收。
3.3流动相的优化2005年版《中国药典》(一部)均采用的HPLC法对中药菊花[15]中的槲皮素和金银花中的绿原酸[16]进行含量测定。参考药典及相关文献中槲皮素和绿原酸[9]的含量测定方法，本实验先后考察了多种流动相系统。分别采用乙腈-水，甲醇-水，甲醇-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液，甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱考察，结果表明，以甲醇-0.4%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，可以达到较满意的分离效果。
4小结
本研究建立了应用HPLC的方法同时检测中成药玉叶解毒颗粒中绿原酸和槲皮素的两个有效成分的含量分析方法，该方法经方法学验证，所建立的测定方法符合定量分析要求，且该方法操作简单，结果准确，可靠，重现性好，可为玉叶解毒颗粒的定量控制提供参考，为玉叶解毒颗粒的质量标准进一步完善提供一定的科学依据。
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