摘要：为调查分析进口蜂蜜中携带幼虫芽孢杆菌的情况和菌株特性，本研究对2017年度来自10个国家和地区的71份蜂蜜样品进行幼虫芽孢杆菌分离并纯化培养，将分离的菌株进行生化、16SrRNA基因鉴定和序列分析。结果显示：分离的31株均为幼虫芽孢杆菌，阳性率为43.6%(31/71);16SrRNA基因序列分析结果显示其与幼虫芽孢杆菌(ATCC9545)等同源性在97%以上。31株分离株16SrRNA基因保守性强，同源性达99.8%以上，遗传变异性较弱。本研究在国内首次为进口蜂蜜传播美洲幼虫腐臭病风险分析提供基础数据，为制定进口蜂蜜风险控制措施提供依据。
关键词：进口蜂蜜;幼虫芽孢杆菌;分离鉴定
幼虫芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae)是一种革兰氏阳性类芽孢杆菌，具有极强的生命力，可在蜂蜜[1]、蜂王浆、蜂胶和蜂花粉中存活，可引起美洲幼虫腐臭病(Americanfoulbrood，AFB)。AFB是一种主要侵害蜜蜂幼虫和蜂蛹的急性毁灭性传染病，一旦发生极易造成蜂群衰弱及死亡，很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失[2]。在曾经暴发过该病的养蜂区域能存活长达35年，因此该病被OIE列入OIE疫病名录(OIE-listediseases)，为必须通报的动物疫病[3]。通过对国内外蜂蜜的标准进行综合分析，发现目前蜂蜜标准主要关注质量、安全、真实性等相关的指标，而忽略了蜂蜜可以传播美洲幼虫腐臭病的风险[4]，因此本研究对进口蜂蜜进行调查，并对分离株的16SrRNA基因进行生物信息学分析，为进口蜂蜜风险控制提供依据。
1材料与方法
1.1样品及主要试剂2017年度宁波地区进口蜂蜜样品71份，分别来自加拿大、澳大利亚、西班牙等10个国家和地区。MYPGP培养基(Mueller-Hintonbroth、酵母抽提物、K2HPO4、丙酮酸盐、葡萄糖)由本实验室配置并添加吡哌酸和萘啶酮酸;细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;2×EasyTaqPCRSuperMix(+dye)购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2细菌的分离培养及鉴定按照OIE《陆生动物诊断实验和疫苗手册》2017版2.02.02的方法进行分离，蜂蜜样品加热至45℃～50℃，PBS或生理盐水稀释，80℃处理10min。离心弃上清液，留下约3mL液体，混匀后，取悬液200μL涂布于MYPGP平板，37℃培养7d～8d，挑选可疑菌落进行纯化、观察菌落形态、镜检和生化鉴定，生化鉴定参照国家行业标准SN/T1681-2011[5]。
1.316SrRNA基因扩增和序列分析按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书，提取细菌DNA作为模板，参照文献[6]报道合成引物，并进行PCR扩增其16SrRNA，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后由上海派森诺生物科技有限公司测序，利用Blast和DNAStar对测序结果进行分析，并构建系统发育树。
2结果与讨论
2.1细菌的分离鉴定对采集的蜂蜜样品进行分离培养，在71份蜂蜜样品中共分离到菌株31株，详见表1，阳性率达到43.6%(31/71)。分离菌在MYPGP平板上观察到整齐、粗糙、扁平或突起的灰白色小菌落(图1A)，镜检结果为革兰氏阳性杆菌(图1B)。生化反应结果与国家行业标准[5]结果一致(表1)。表明分离得到的细菌为幼虫芽孢杆菌。
2.216SrRNA基因鉴定和序列分析细菌16SrRNA基因序列具有相对稳定和易变异的双重特点，常用于细菌的分类鉴定，DirkGevers等的研究结果表明菌株之间16SrRNA的序列同源性≥97%的才有可能是同种细菌[7]。31株分离细菌的PCR产物约为1400bp(图略)，经测序及比对分析结果显示所有菌株的16SrRNA基因序列与P.larvae(ATCC9545)等标准菌株同源性大于97%，可以判定这些菌株均为幼虫芽孢杆菌。
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16SrRNA序列变化是微生物的系统发育和进化的重要的指示之一，本研究利用DNAStar软件中MegAlign对包括31株分离株(分别来自于澳大利亚、法国，韩国、加拿大、罗马尼亚、台湾、西班牙、希腊、新西兰、匈牙利)、3株ATCC保藏菌株(ATCC13537、ATCC25368、ATCC9545)，1株DSM保藏菌株(DSM3615)进行核苷酸比对和同源性分析。结果显示31株分离菌的16SrRNA核苷酸序列同源性为99.8%～100%，具有较高的保守性和稳定性，遗传变异较低。基于该基因的系统发育树结果显示，35株分离菌分成2个大分支，ATCC9545单独一支，其原因可能是GenBank中ATCC9545的16SrRNA中存在多个兼并碱基原因。加拿大分离株(4株)、韩国分离株(1株)、台湾分离株(1株)、澳大利亚分离株(1株)在同一分支;法国分离株(1株)和新西兰分离株(1株)在同一分支(图2)，由此表明幼虫芽孢杆菌的16SrRNA比较保守，聚类分析发现基因差异较小，不适宜用作区分不同地理来源分离株的分子遗传标记。
