摘要 利用稀释涂布法从番茄根际土壤中分离放线菌，并以番茄灰霉菌为靶标，利用对峙培养法和牛津杯法筛选拮抗放线菌，得到一株具有较强抑菌活性的放线菌LA-5.通过培养特征、生理生化特性及基于16SrDNA序列系统进化分析，将菌株LA-5初步鉴定为链霉菌.复筛结果显示，LA-5发酵滤液对番茄灰霉菌孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用，其中100倍发酵滤液对孢子萌发抑制率和菌丝生长抑制率均在50%以上;受抑制菌落呈白色，气生菌丝萎缩稀疏，菌丝纤细、分支明显减少.离体防效试验显示，菌株LA-5发酵原液对番茄灰霉病防效可达83.4%.该菌株有望开发为防治番茄灰霉病的生防菌株.
关键词 番茄灰霉菌;链霉菌;抑菌活性;生物防治
由番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病是一种世界性的病害.该病原菌产孢量大、寄主范围广泛，能够侵染包括番茄、黄瓜、辣椒、草莓、葡萄等200多种作物，不仅在植株生长期间发生严重，而且在采后储藏、运输过程中也发生严重，对我国果蔬生产及产后储藏造成了严重的经济损失[1].灰霉病属于低温高湿病害，蔬菜、花卉等保护地重茬连作和高湿环境，为该病发生创造了更为有利的条件[2].目前，番茄灰霉病主要依靠化学防治，随着用药次数和用药量不断增加，加之病原菌遗传变异迅速，病原菌的抗药性也不断增加.目前，番茄灰霉菌已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯氨基甲酸酯类、苯胺基嘧啶类和酰胺类杀菌剂产生了不同程度的抗性，防治效果逐年下降.而且大量化学农药的使用严重威胁人们的食品安全和污染生态环境[3].国家农业部已提出到2020年，我国农业要实现“一控两减三基本”的目标，其中主要农作物病虫害绿色防控覆盖率达到30%，化学农药使用量实现零增长.因此，寻找可替代性生物农药以克服农药残留和病菌的抗药性将是灰霉病防治中亟需解决的重要问题.
放线菌存在于各种自然生态环境中，种类繁多，代谢功能各异，能够产生种类丰富的次级代谢产物，是生物活性物质的重要来源.近年来，我国相继成功开发了井冈霉素、春雷霉素、中生霉素等几十种农用抗生素[4].不同结构类型的农用抗生素作用方式有很大差异，归纳起来有以下几点，通过抑制几丁质的合成来破坏病原真菌细胞壁的完整性;作用于真菌原生质膜造成溶质渗漏;作用于蛋白质合成系统阻碍肽键的形成;作用于能量代谢以及激活植物自身免疫，从而起到防治作用[5-6].Dame等[7]从海洋放线菌(Streptomycesspp.)中获得的巴马霉素(pamamycin)、寡霉素a(oligomycinA)、寡霉素b(oligomycinB)和棘孢链菌素(echinosporin)，通过抑制孢子游动导致孢子细胞壁溶解，从而有效防治葡萄霜霉病(Plasmoparaviticola).放线菌(Streptomycesspp.)TN258发酵提取物能够使腐霉菌Pythiumultimum卵孢子扭曲畸形，菌丝生长受到极大的抑制[8].积雪草(Centellaasiatica)根节内生放线菌(Streptomycesspp.)CEN26代谢产生的2，5-双(羟甲基)呋喃乙酸(BHMFOAC)化合物可导致甘蓝黑斑病菌(Alternariabrassicicola)分生孢子畸形，附着孢不能形成及孢子萌发延迟[9].Shrivastava等[10]从印度恒河平原土壤中分离的嗜盐放线菌K20，产生几丁质酶来破坏菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)的菌丝细胞壁，从而起到明显的拮抗作用.
本研究从山西省平陆县蔬菜大棚土壤样品中分离到一株对番茄灰霉菌具有较好拮抗作用的放线菌LA-5，通过形态学、分子生物学等方法对其进行鉴定，在室内测定发酵滤液对番茄灰霉菌分生孢子萌发和菌丝生长的影响，并进行离体防效研究，旨在筛选对番茄灰霉病有拮抗作用的高效生防菌，为今后番茄灰霉病的生物防治奠定基础.
1材料与方法
1.1供试材料
土壤样品采自山西运城平陆县蔬菜大棚，铲去表层浮土，随机在健康番茄植株根际挖取地表下5～10cm处新鲜土壤，装入无菌自封袋，放入冰盒内，带回实验室存于4℃冰箱备用.供试病原菌番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)分离自运城市盐湖区北相镇蔬菜种植大棚中番茄发病果实.
放线菌分离、纯化和形态特征观察采用高氏一号合成培养基;番茄灰霉菌培养和拮抗试验采用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基;种子发酵培养基采用高氏一号液体培养基;基础发酵培养基采用小米浸汁培养基[11];离体防效试验中所用啶酰菌胺原药购自上海源叶生物科技有限公司.
1.2土壤放线菌的分离与纯化
采用平板稀释法分离放线菌.将风干土样用研钵磨碎，称取10g倒入装有90mL无菌水的三角瓶中，28℃180r·min-1震荡30min后静置5min，得到原液.取原液1mL并以10倍梯度稀释，分别配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.2mL加到高氏一号培养基(含50mg·mL-1的K2GrO7)平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5～7d后挑取不同的单菌落划线纯化[12].
1.3拮抗放线菌菌株的筛选
1.3.1拮抗菌株的初筛采用对峙培养法进行筛选[13].将放线菌接种在高氏一号琼脂培养基平板培养7d，用打孔器打取φ=7mm的菌饼待用.制备PDA培养基平板，将番茄灰霉菌菌饼(φ=7mm)接种于平板中央.以此为中心，按照正方形的布局将同种放线菌菌饼接种在距病原菌1.0cm的正方形边长中点处，以只接种病原菌为对照.23℃恒温培养5d，观察病原菌菌落是否形成隔离区间，并测量放线菌菌落边缘与病原菌菌落边缘的距离，每处理重复3次.
1.3.2放线菌的抑菌活性复筛对初筛具有拮抗效果的放线菌进行发酵，首先将待测菌接种在小米培养基上，28℃180r·min-1振荡培养72h，制成种子液，然后再按10%的接种量接入到装液量为150mL的发酵培养基中(250mL三角瓶)，在上述条件下振荡培养5d，发酵结束后，分离发酵液和菌体，发酵液先用孔径为0.45μm的微孔滤膜抽滤，再用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤到无菌离心管中置于4℃保藏备用.
滤纸条法:采用滤纸条法测定菌株发酵液对番茄灰霉菌的抑制作用[14].将50mL发酵7d、108CFU·mL-1的菌株发酵液置于50mL离心管中，8000r·min-1离心取上清液，然后用微孔滤膜(0.22μm)抽滤除菌，得无菌发酵液，置于灭菌容器中4℃保藏备用.用发酵液浸润无菌滤纸条，晾干后对称贴在PDA培养基中，培养皿圆心位置接种番茄灰霉菌菌饼，以无菌水作为对照，重复3次.
牛津杯法:制备浓度为1.0×107个·mL-1番茄灰霉菌孢子悬浮液，将150μL孢子悬浮液均匀涂布在PDA平板上，待吹干后，将7.8mm×6mm×10mm的无菌牛津杯均匀放置在PDA平板上，并轻轻按压使之与培养基充分接触.将放线菌无菌发酵滤液200μL置于牛津杯中，以无菌水为对照，将平板置于23℃下恒温培养3d，观察是否有抑菌圈出现，并测量抑菌圈的大小，每处理3个重复.
1.4拮抗菌株的鉴定
1.4.1表型特征和生理生化测定在高氏一号培养基上划线培养，培养基内倾斜插入无菌盖玻片，7～10d后通过光学显微镜、扫描电镜观察菌丝形态、孢子特征，并随时观察菌落形态、基内菌丝颜色及可溶性色素的有无，参考文献报道的方法对菌株进行初步鉴定[15].菌株生理生化特性分析参照《链霉菌鉴定手册》[16]和《放线菌分类基础》[17]等的方法.
1.4.2分子鉴定以细菌基因组DNA提取试剂盒(艾德莱)提取放线菌基因组DNA，以细菌16SrDNA通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'作为扩增引物进行PCR扩增.50μL反应体系:2×TaqMasterMix25μL、DNA模板1μL、上下游引物各1μL，超纯水(ddH2O)补足至50μL.反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环;72℃终延伸10min[18].
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收后送到上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast分析比对，调出与其序列同源性较高的相关模式菌株的16SrDNA序列.采用MEGA6.0软件中邻接法(neighbour-joining，N-J)构建系统发育树，确定菌株分类地位[19-20].
1.5菌株对番茄灰霉菌的抑菌活性及防效测定
1.5.1发酵滤液对番茄灰霉菌菌丝生长的影响试验
采用菌丝生长速率法:23℃培养箱内将番茄灰霉菌在培养基平板上培养5～7d后，用打孔器在菌落边缘取直径7mm菌饼.将无菌发酵原液与冷却至50℃左右的PDA培养基按照20%、10%、2%、1%、0.5%和0.25%比例混匀，使其稀释成5、10、50、100、200和400倍发酵滤液，然后分别制成含药培养基平板.在平板中央接种番茄灰霉菌菌饼(φ=7mm)，设置3个重复，以加入等量无菌水的处理为对照，23℃下恒温培养5d后，用十字交叉法测量菌落生长直径，根据以下公式计算菌株的平均菌丝生长抑制率.挑取各处理及对照菌落菌丝，在光学显微镜下观察菌丝形态变化[21].
菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100%
1.5.2发酵滤液对番茄灰霉菌孢子萌发的影响试验
制备浓度为1.0×107个·mL-1番茄灰霉菌孢子悬浮液，将放线菌菌株发酵液与无菌水以20%、10%、2%、1%、0.5%和0.25%比例混匀，使其稀释成5、10、50、100、200和400倍，将适量番茄灰霉菌孢子悬浮液母液滴加到稀释后的发酵液中，制成终浓度为1.0×105个·mL-1的孢子悬浮液，以无菌水为对照，每个处理3个重复，于23℃暗培养48h后镜检，每处理观察3个视野，每个视野观察30个分生孢子，光学显微镜下统计孢子萌发的数量.以抽出芽管、长出菌丝为标准，判断孢子是否萌发.重复3次，按公式计算孢子萌发率.
孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/(对照孢子萌发率)×100%
1.5.3菌株发酵液对番茄灰霉病的防治效果试验利用组织法测定放线菌发酵液对番茄灰霉病的防治效果.选取直径约5cm、大小相似、生长健康的番茄果实35，平均分为7组，分别先以放线菌菌株无菌发酵液原液、10、20、50、100倍液作为保护剂对番茄喷雾处理，喷雾量以刚好均匀、不产生滴液为宜.待晾干后用106个·mL-1番茄灰霉菌孢子悬浮液接种果实微创伤口，接种量以喷雾均匀不产生滴液为宜.实验以无菌水作为阴性对照(CK)，3.9μg·mL-1的啶酰菌胺为阳性对照，设置3个重复，5d后测量并记录病斑面积，计算防效.
1.6数据处理
采用Excel2016软件进行数据处理，采用DPS7.5统计分析软件对数据进行差异显著性检验(Duncan氏新复极差法，α=0.05).
2结果与分析
2.1放线菌分离结果
将土壤样品制成悬液并以10倍逐级稀释，将悬液均匀涂布在高氏一号琼脂培养基平板上，置于28℃培养箱内培养5～7d，3份土样中共分离到放线菌23株，根据菌落形态、颜色初步去除重复，获得放线菌纯培养18株，编号分别为LA-1～LA-18.
2.2拮抗放线菌的筛选
2.2.1拮抗放线菌初筛根据平板对峙培养结果，对番茄灰霉菌具有抑制作用的放线菌有4株，其中抑菌效果最高的菌株编号为LA-5，抑制率高达72.6%(图1、表1).
2.2.2拮抗放线菌复筛将初筛得到效果较好的LA-5进行发酵，用牛津杯法对放线菌抑菌活性进行复筛.结果表明，放置发酵液的牛津杯边缘出现明显的抑菌圈，抑菌圈直径可达28.7mm(图2);滤纸条试验表明，蘸取发酵液的无菌滤纸条可以明显抑制菌落生长，菌落生长狭长，而对照组病原菌能越过滤纸条，无障碍生长.因此，放线菌LA-5可作为番茄灰霉菌生防菌进行后续试验.
2.3菌株LA-5鉴定结果
2.3.1形态及培养特征菌株LA-5在高氏一号培养基上菌落扁平状，黑褐色，孢子丝颜色黑灰色，培养10d后产咖啡色可溶性色素，菌落背面呈棕黑色(图3);光学显微镜下基丝不断裂、气生菌丝形成孢子丝，孢子丝直、柔曲;在扫描电镜下观察，孢子为短圆柱形，表面光滑、链生;轴长约0.6μm，径长约1.0μm(图4).在大多数培养基上生长良好，在不同鉴别培养基上的培养特征见表2.
2.3.2生理生化特征菌株生理生化特性分析参照《链霉菌鉴定手册》[16]和《放线菌分类基础》[17]等的方法进行.结果表明，菌株LA-5能使淀粉水解、牛奶凝固和胨化，以及明胶液化，不能使硝酸盐还原和产生硫化氢;能很好利用纤维素、D-葡萄糖、蔗糖，不能利用麦芽糖、鼠李糖、D-果糖(表3).
2.3.3分子鉴定从LA-5新鲜菌体中提取基因组DNA，采用通用引物(27F和1492R)进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测后测序.结果表明，菌株LA-5的16SrDNA核苷酸全序列总长为1391bp.将所得序列提交到GenBank获得登录号MH102299，与GenBank中已登录的基因序列进行BLAST分析比对，发现与菌株LA-5同源性高于98%的菌株均属于链霉菌属，选取12个典型菌株的16SrDNA序列用MEGA6.0软件Neighbor-Joining法构建系统进化树构建系统发育树.结果表明，菌株LA-5与Streptomyceschungwhensis属于同一分支，其序列最大相似性为99%(图5).因此将菌株LA-5初步鉴定为S.chungwhensis.
2.4菌株LA-5对番茄灰霉菌的抑菌活性及防效
2.4.1发酵滤液对番茄灰霉菌分生孢子萌发的抑制作用经发酵滤液处理的孢子悬液置于23℃培养箱暗培养48h，结果表明，LA-5发酵滤液对番茄灰霉菌分生孢子萌发具有抑制作用.稀释5倍发酵滤液对番茄灰霉菌孢子萌发抑制率达100%，随着稀释倍数增加，对孢子萌发抑制率逐渐下降，其中，100倍发酵滤液对病原菌孢子萌发抑制率仍在50%以上，当稀释到400倍时，孢子萌发抑制率小于10%，基本失去抑制作用(表4).
2.4.2发酵滤液对番茄灰霉菌菌丝生长的抑制作用LA-5发酵滤液对番茄灰霉菌菌丝生长具有抑制作用，稀释5倍发酵滤液对病原菌菌丝生长抑制率大于90%，当发酵滤液稀释100倍时，菌丝抑制率下降到51.3%，随着稀释倍数增加，菌丝抑制率逐渐下降，当稀释400倍时，菌丝抑制率为6.4%，基本失去抑制作用(表4).形态观察结果表明，对照组菌落呈灰色，气生菌丝发达茂盛，菌丝颜色较深，分支发达;而经LA-5发酵滤液处理的菌落呈白色，气生菌丝稀疏，菌丝纤细，分支极少(图6).
2.4.3发酵滤液对番茄灰霉菌的离体防效将LA-5发酵滤液稀释后进行离体防效测定，结果表明，3.9μg·mL-1的啶酰菌胺对灰霉菌的防治效果为85.1%，发酵滤液对番茄灰霉菌具有良好的防治效果，可有效抑制病斑的扩展.发酵滤液原液的防效高达83.4%，与阳性对照无显著差异;当发酵滤液稀释到50倍时，防治效果下降到52.3%，稀释到100倍时，防效下降到11.3%，基本失去防治作用(表5).
期刊推荐：《应用生态学报》是中国科学院主管、中国生态学学会和中国科学院沈阳应用生态研究所联合主办的综合性学术期刊，创刊于1990年，由科学出版社出版。刊登内容主要包括：森林生态学、农业生态学、草地生态学、渔业生态学、海洋与湿地生态学、资源生态学、景观生态学、全球变化生态学、城市生态学、产业生态学、生态规划与生态设计、污染生态学、化学生态学、恢复生态学、生态工程学、生物入侵与生物多样性保护生态学、流行病生态学、旅游生态学和生态系统管理等。读者对象主要：从事生态学、地学、林学、农学和环境科学研究、教学、生产的科技工作者，有关专业学生及经济管理和决策部门的工作者。有投稿需求的作者，可以直接与期刊天空在线编辑联系。
