摘要:【目的】调查链格孢菌在菊科植物上的危害。【方法】2016—2017年，从湖北、北京、安徽及云南各地采集得到菊科千里光族植物瓜叶菊(Pericallishybrida)、银叶菊(Seneciocineraria)及白子菜(Gynuradivaricate)叶斑病病样4份。采用单孢分离的方法从各寄主上分别获得形态相似的链格孢菌大孢子种菌株。随后从各寄主分离物中筛选出1个代表菌株进行致病性、形态学及多基因位点(rDNA-ITS、GAPDH、Alta1、EF1-α、RPB2和ATPase)序列分析研究。【结果】4个菌株均可引起其寄主发生病害，且均为瓜叶菊链格孢菌(Alternariacinerariae)。【结论】这是该菌种在国内的首次报道，也是该菌引起银叶菊与白子菜叶斑病病害的首次报道。
关键词:千里光族;瓜叶菊链格孢;叶斑病;形态学;多基因序列
千里光族(SenecioneaeCass.)植物能在多种生态环境生长，是菊科11族中最大的1个族群[1-2]。在中国共有23属[3-4]，种类丰富，并不断有新种发现[5-6]。千里光族植物主要有药用及观赏两种经济价值。其中，款冬属、菊三七属、橐吾属、蟹甲草属等具有化痰止咳、活血化瘀、治疗类风湿性关节炎等功效，多作为中草药[7]。现代医药学研究发现：药用千里光植物富含黄酮类、萜烯类、绿原酸、生物碱等物质，可抗衰老、降血糖、抗凝血、抗细菌等[8-10]。袁六六等[11]从白子菜(Gynuradivaricate)茎叶提取到可改善糖尿病小鼠血脂及肝脏保护作用的物质，具有防治糖尿病病人肝损伤的潜能。隶属于千里光族的千里光属银叶菊(Seneciocineraria)因其全株密被白色绒毛的显著特征，多用于城市园林造景;瓜叶菊属瓜叶菊(Pericallishybrida)花期恰逢少花的冬春，且其花色丰富、花姿秀丽、花形典雅，具有很高的市场占有率[12]。然而，此类植物在生长发育过程中常受到各种病害的侵染危害，影响其药用价值及观赏价值。
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国外已报道Alcidiumhualtatinum等12种真菌可侵染银叶菊(https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/)，LU[13]报道Corcosporasp.侵染危害白子菜。瓜叶菊病害报道较多，如白粉病、灰霉病、褐斑病、煤污病、病毒病等[14]。RASOULPOUR等[15]在瓜叶菊植株上分离出的西红柿黄环病毒(Tomatoyellowringvirus)对菊科、藜科、豆科及茄科植物均可致病。本课题组在2016—2017年开展菊科植物病原链格孢菌调查研究时，采集得到菊科千里光族植物银叶菊、瓜叶菊和白子菜叶斑病病样4份，本研究利用致病性、形态学和多基因位点(rDNA-ITS、GAPDH、Alta1、EF1-α、RPB2和ATPase)序列分析的方法对其进行研究，以期能对千里光族植物病害的防治提供基础依据。
1材料与方法
1.1病样采集
从全国范围内采集具有链格孢菌危害典型症状(黑斑、褐斑、轮斑)的菊科植物的叶斑病病样，拍照记录症状，将所采集的病样分别放入无菌透明塑封袋内，标注采集时间、地点和植物种类等信息。
1.2试验方法
1.2.1菌株的分离与保存
对所采集的病样组织，用无菌小刀切取病健交接处，置于装有湿润滤纸的培养皿(90mm)内，25℃下保湿培养2d，在体视显微镜下观察其产孢后，进行单孢分离;并对在PDA培养基(马铃薯葡萄糖汤粉24g，琼脂20g，水1000mL)上生长的纯培养物进行编号及菌种保藏。
1.2.2致病性检测
经初步形态学观察后，从各病样分离物中筛选出1个代表菌株作为供试菌株。供试菌株在PDA培养基上培养2~3d后，挑取边缘菌丝转接于V8培养基(V8蔬菜汁175mL，碳酸钙3g，琼脂20g，水1000mL)上，在22℃恒温条件下，每天光照8h，培养7d[16]。因其产孢困难，故用无菌接种环刮伤菌落表面菌丝，紫外线(UV)照射2h诱导其产孢，于培养箱中继续培养2d后，用无菌水洗脱分生孢子，过滤后离心，再用无菌水将滤液配制成孢子悬浮液(105mL−1)。寄主植物均从病样采集地购买，于实验室温室种植两个月确保健康生长后进行致病性试验。将配制好的孢子悬浮液均匀喷洒在经过75%酒精表面消毒的各健康寄主植物上，至叶片及花朵湿润有水滴流下，室温分别培养于不同的无菌保湿装置中。每天观察并拍照记录发病情况。待发病后，从发病部位再次分离病原物，与接种物进行形态学比对，确定是否一致，完成Koch’sRule的致病性验证。以喷洒无菌水作为对照，试验使用3株长势相同的植株进行重复。
1.2.3形态学观察
菌落形态：将供试菌株接种于PDA培养基上，3~5d后用直径为6mm的无菌打孔器切取菌落边缘菌丝团块，转接于直径为90mm的PDA培养皿中。25℃恒温黑暗培养7d后，测量菌落大小，拍照并记录菌落颜色及形态[17]。
孢子形态：挑取在PDA培养基上生长3~5d的供试菌株菌丝接种在V8培养基上，产孢培养条件同1.2.2节所述，9d后以乳酚油为浮载剂制成玻片，在显微镜(NiKONDS-Ri2)下观察。拍照并记录其分生孢子形态、色泽等，随机测量80个成熟分生孢子大小[16]。
产孢表型：将供试菌株回接于寄主植物，发病后，切取病健交接处，置于装有2层浸湿滤纸的塑料培养皿(90mm)内，在22℃恒温条件下，每天8h光照，培养1d后，在徕卡显微镜(M205A)下观察其产孢表型并拍照，共观察3d。
1.2.4分子系统学研究
将供试菌株转接于PDA培养基上培养5~7d后，收集适量菌丝于1.5mL离心管中，采用改良CTAB法提取总DNA[18]。对核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)、甘油醛-3-磷酸(GAPDH)、链格孢过敏源基因(Alta1)、翻译延伸因子1-α(EF1-α)、RNA聚合酶第二大亚基(RPB2)、质膜腺苷三磷酸酶(ATPase)基因片段进行PCR扩增。引物分别为ITS5/ITS4[19]、gpd1/gpd2[20]、Alta1-for/Alta1-rev[21]、EF446F/EF1473r[22]、RPB2-5F/RPB2-7Cr[23]、ATPF/ATPR[24]。PCR扩增使用25μL反应体系：DNA模板2μL，正反引物各1.25μL，TaqMix12.5μL，ddH2O8μL。PCR产物经含有核酸染料(GoldenView，北京博迈德基因技术有限公司)的1%琼脂糖凝胶检测后，送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行纯化测序，采用双向测序以保证结果的完整性与准确性。
测序结果运用软件BioEdit7.0对比分析。将完成校正的完整序列在NCBI网站上进行BLAST同源性分析，下载与其相近的序列。利用MEGA7中邻位加入法(neighbor-joining)构建系统发育树，以A.helianthiinficiens(CBS208.86，YZU161169)作为外群(outgroup)，自展系数检测(bootstrap)为1000次循环。
2结果与分析
本研究于2016年在湖北荆州西城街道发现瓜叶菊植株叶片上有圆形或不规则形棕褐色病斑(图1a);2017年在北京市植物园采集得到的瓜叶菊病样，其病斑散乱分布于叶片上，呈褐色，中央灰白色，具同心轮纹(图1c);2017年于安徽合肥市植物园采集得到银叶菊病样，病症常出现在下部叶片与叶缘，叶片淡褐色呈现出不规则坏死，后期整个叶片干枯(图1e);2017年于云南昆明市植物园发现白子菜叶片上散乱分布近圆形或椭圆形褐色病斑，具同心轮纹，病斑中央有白色小点，周围有褪绿现象(图1g)，后期整个叶片枯萎凋落。从以上地区采集得到的4份病样中共分离得到菌株20株，根据菌落形态，从各寄主分离物中筛选1株代表菌株进行后续研究，分别编号为YZU161064(瓜叶菊—湖北荆州)、YZU171105(瓜叶菊—北京)、YZU171228(银叶菊)、YZU171971(白子菜)。
2.1致病性测定
菌株YZU161064：室内接种24h后叶片出现水渍状斑点，花瓣出现黄褐色小斑点;3d后病情加重，花瓣病斑周围着生灰色菌丝，叶片出现大量不规则黑褐色坏死斑点，花瓣坏死斑点扩大至整个花瓣，有凋落现象(图1b)。对照未发病。
菌株YZU171105：室内接种24h后开始发病，叶片上出现水渍状小点，花瓣有侵染现象，茎上出现褐色斑点;3d后病斑加重，叶片上小点逐渐扩展成圆形或不规则形黑褐色病斑，花瓣枯黄、萎蔫(图1d)。对照未发病。
菌株YZU171228：室内接种发病较慢，接种15d后，下部叶片叶缘黑褐色坏死(图1f);20d后，整株植株感病，叶片枯萎。对照未发病。
菌株YUZ171971：室内接种1d后叶片出现褐色小点，随后病斑逐渐扩大;3d后叶片感病处有褪绿变黄现象，茎秆也可感病(图1h);7d后部分叶片枯萎凋落。对照未发病。
将发病植株叶片(花瓣)再次保湿培养，挑取单孢进行培养后，获得与接种病原菌形态学相同的菌株，满足柯赫氏法则。
2.2形态学特征
菌株YZU161064：在PDA培养基上生长7d的菌落近圆形，边缘光滑，中央灰橄榄色，边缘灰白色，菌丝浓密、绒毛状，直径约63~64mm(图2a)。在寄主植物上分生孢子单生或2个串生，分生孢子梗直或弯曲，少有分支(图2b)。在V8培养基上分生孢子呈卵形或倒棒状，表面光滑，有4~9个横膈膜，孢身大小为(50~95)μm×(15~35)μm，短喙或无喙，具柱状假喙，喙长(10~50)μm×(4~10)μm，基部钝圆(图2c)。
菌株YZU171105：在PDA培养基上生长7d的菌落近圆形，灰白色至淡黄褐色，边缘不光滑，直径约39mm(图2d)。寄主植物上分生孢子单生或2~3个串生，分生孢子梗直立(图2e)。在V8培养基上分生孢子倒棒状或阔倒棒状，表面光滑，孢身(50~90)μm×(15~35)μm，具4~9横膈膜，分隔处隘缩，短喙或无喙，喙长(10~50)μm×(4~10)μm(图2f)。
菌株YZU171228：在PDA培养基上生长7d的菌落呈圆形，白色，中央绿橄榄色，菌丝浓密，边缘光滑，直径约59~60mm(图2g)。在寄主植物上，分生孢子梗直或弯曲，分生孢子单生或2~3个串生(图2h)。在V8培养基上，分生孢子倒棒状、阔倒棒状或狭倒棒状，孢身大小为(50~90)μm×(20~35)μm，具4~8个横膈膜，分隔处隘缩,喙短或无，喙长(10~30)μm×(4~10)μm(图2i)。
菌株YZU171971：在PDA培养基上生长7d的菌落呈圆形，菌落呈乳白色，菌丝疏松，边缘完整，直径56~57mm(图2j)。寄主植物上分生孢子梗直或弯曲，分生孢子单生或2个串生(图2k)。在V8培养基上，分生孢子呈广卵形、倒棒状或阔棒状，孢身大小为(50~85)μm×(15~30)μm，4~9个横膈膜，喙短或无，喙长(10~30)μm×(4~10)μm(图2l)。
病原菌的菌落形态、孢子大小及形态、产孢表型与前人[16-17]描述相似，表明这4株菌株为Alternariacinerariae。
2.3分子系统学检测
通过对单个菌株rDNA-ITS、GAPDH、Alta1、EF1-α、RPB2和ATPase基因进行PCR扩增，分别获得大小为517、563、472、239、722、1194kb的DNA片段，将处理后的测序结果提交GenBank获得登录号(表1)。
将所有菌株的单个基因序列在NCBI上进行BLAST分析，均与Alternariacinerariae代表菌株CBS116495呈现100%的同源率。基于rDNAITS、EF1-α和RPB2基因序列的单个系统发育树显示：供试菌株YZU161064、YZU171105、YZU171228和YZU171971并无种内差异，与A.cinerariaeCBS116495形成1个小分支，进一步与同属于Sect.Sonchi的A.sonchi(CBS119675)形成1个大分支，支持率都高达97%以上(图3)。基于GAPDH、Alta1和ATPase基因构建的单基因系统发育树也揭示了供试菌株YZU161064、YZU171105、YZU171228和YZU171971在分子生物学分类上隶属于A.cinerariae，但是这3个基因也表明了不同寄主植物上分离得到的供试菌株的碱基序列存在差异。基于6个基因构建的联合系统发育树中(图4)，供试菌株YZU161064、YZU171105、YZU171228、YZU171971与菌株CBS116495(A.cinerariae)以100%的支持率聚集成1个分支，且与A.sonchi一起聚集于Sect.Sonchi。因此，多基因序列分析也表明4个供试菌株均为瓜叶菊链格孢(A.cinerariae)。
3讨论
瓜叶菊链格孢菌(A.cinerariae)隶属于丝孢纲丝孢目链格孢属，系统发育研究发现该菌属于Sect.Sonchi[25]，于1931年在日本瓜叶菊上首次发现[26]。瓜叶菊链格孢菌常侵染千里光族中瓜叶菊属及菊三七属植物使其发病[27]。NISHIKAWA等[17]从瓜叶菊、红凤菜及大吴风草上分离得到瓜叶菊链格孢菌，其研究结果发现不同寄主植物上的菌株致病力差异较大。本研究将4个菌株分别离体接种在3个寄主植物叶片上，也表现出不同的致病性强弱(结果未显示)。同时，各菌株菌落形态差异较大，这可能与采集地域或寄主不同有关。此外，本研究多基因位点序列分析表明瓜叶菊链格孢菌存在种内差异性，然而4个菌株的分生孢子大小、色泽、隔膜数均无明显差异，与NISHIKAWA等[17]的研究结果存在一定差异，这可能与孢子的成熟度有一定关系，建议刮伤菌丝后继续培养时间增加1~2d。
国外已报道46种链格孢菌危害菊科植物，国内报道20种[28]。本研究通过致病性检测、形态学及分子系统学对从4个地区3种千里光族植物上分离的链格孢菌分析后发现：引起瓜叶菊、银叶菊、白子菜叶斑病的病原菌均为瓜叶菊链格孢菌(A.cinerariae)。这是该菌种在国内的首次报道，也是该菌引起银叶菊与白子菜叶斑病病害的首次报道，为中国菊科千里光属植物的该类病害的防治提供了重要的理论依据。
