摘要:目的建立一种超临界流体色谱方法拆分调血脂药阿托伐他汀钙与其对映异构体杂质，并对对映异构体杂质进行含量测定。方法采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2色谱柱(3.0mm×150mm，2.5μm)，以超临界二氧化碳/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)为流动相，背压为13.8MPa，进样量为4μL，柱温为45℃，流速为1.5mL·min-1，于244nm波长处分离阿托伐他汀钙及其对映异构体。结果阿托伐他汀钙与其对映体在5min内均已出峰完全，分离度达4.1，对映体在2.5～50μg·mL-1内线性关系良好，相关系数为0.9999(n=6)。对映体的检测限与定量限分别为1.0μg·mL-1(S/N=3)和2.5μg·mL-1(S/N=10);阿托伐他汀钙原料药中对映异构体的平均加样回收率为100.40%。结论利用超临界流体色谱分离阿托伐他汀钙手性杂质与使用普通液相色谱相比可极大缩短分离时间，减少有机溶剂的使用量，重现性好，可有效用于阿托伐他汀钙的质量控制。
关键词:阿托伐他汀钙;对映体杂质;超临界流体色谱;手性拆分
阿托伐他汀钙是一种调血脂药，是HMG-CoA还原酶的选择性及竞争性抑制剂，可有效降低纯合子家族性高胆固醇血症患者的低密度脂蛋白水平[1]。《英国药典》2017版(BP2017)、《欧洲药典》9.0版(EP9.0)、《美国药典》40版(USP40)均收载阿托伐他汀钙，均制定了对映体杂质检查项，《中国药典》2015年版未收载此药。阿托伐他汀钙结构中有两个手性中心，药理活性成分为阿托伐他汀钙(R，R)型，结构式见图1，其余3个异构体均为杂质，其中非对映异构体(R/S，S/R)在国外药典有关物质项条件下可与其他杂质同时实现分离，而对映异构体(S，S)型(对映体)则采用正相色谱系统进行分离检测。
超临界流体色谱(SFC)以超临界流体做流动相，因具有较强的溶解能力，及良好的传质能力，可利用其溶剂化能力来进行分离分析。SFC兼具气相色谱和液相色谱的特点，相比普通液相而言能获得更快更好的分离分析效率，在难以实现快速良好分离的中药成分和手性药物中均有较大优势[2-3]。SFC采用二氧化碳作流动相最大的局限性在于无法分离极性大的化合物，有些无法洗脱的化合物需通过加入改性剂和少量添加剂来实现分离洗脱。目前有报道采用高效液相分离阿托伐他汀钙及对映体[4-5]，分离时间达数十分钟，而采用SFC进行快速手性拆分的方法尚没有报道。
本实验拟采用超临界流体色谱法结合手性固定相对阿托伐他汀钙及其对映体杂质进行拆分，并对原料药中对映体的量进行定量测定。
1仪器与试药
WatersAcquityUltraPerformanceConvergenceChromatography(UPC2)系统，光电二极管阵列检测器(PDA)。BP211D型精密天平(Sartorius公司)。Trefoil系列色谱柱如下:ACQUITYUPC2TrefoilCEL1，ACQUITYUPC2TrefoilCEL2，ACQUITYUPC2TrefoilAMY1，3根色谱柱规格相同(3.0mm×150mm，2.5μm)。甲醇、乙醇、乙腈、三氟乙酸均为色谱纯。二氧化碳(纯度99.99%)。
阿托伐他汀钙对照品(中国食品药品检定研究院，批号:100590-201303，纯度95.3%)，阿托伐他汀钙对映体杂质对照品(EDQM，批号:Y0001332)，阿托伐他汀钙消旋体混合物对照品[RANBAXY，B.NO:SYK(D-716)36，Chromatographicpurity:98.5%，Chiralpurity:Enantiomer44.1%，Atorvastatin55.9%]。阿托伐他汀钙原料药3批:2批由BSMsinochem(LotNo:3141400240，3141400257)提供，1批由RANBAXYLaboratories(LotNo:2743173)提供。
2方法与结果
2.1溶液的配制
2.1.1对照品溶液精密称取对映体杂质对照品2.5mg于25mL量瓶中，加甲醇5mL振摇溶解，用乙醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.1mg·mL-1的对映体储备液。精密量取适量用乙醇稀释制成10μg·mL-1的对映体对照品溶液。
2.1.2系统适用性溶液精密称取阿托伐他汀钙对照品30mg于10mL量瓶中，加乙醇少量振摇溶解后精密加入对映体储备液1mL，用乙醇稀释至刻度，制成含阿托伐他汀钙3.0mg·mL-1，对映体杂质10μg·mL-1的系统适用性溶液。
2.1.3供试品溶液精密称取3批阿托伐他汀钙原料适量，加少量甲醇溶解后用乙醇定量稀释混匀制成每1mL含3.0mg的溶液，作为供试品溶液。
2.2色谱条件及系统适用性
色谱柱筛选初始色谱条件为:流动相为CO2/甲醇(80/20，V/V);流速:1.0mL·min-1;背压:13.8MPa;柱温40℃;进样量:1μL;检测波长:244nm。测定色谱条件为:色谱柱采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2(3.0mm×150mm，2.5μm);流动相为CO2/0.1%TFA-甲醇(78/22，V/V);流速为1.5mL·min-1;背压为13.8MPa;柱温45℃;进样量4μL;检测波长为244nm。
取系统适用性溶液进样4μL，色谱图见图2，阿托伐他汀钙与其对映体分离度为4.19。
2.3检测限与定量限
精密量取“2.1”项下对映体对照品溶液，进行逐级定量稀释，进样量4μL，以信噪比S/N分别为3和10计算，检测限为1.0μg·mL-1，定量限为2.5μg·mL-1。
2.4线性与范围
精密量取“2.1”项下对映体储备液，用乙醇定量稀释制成含对映体分别为2.5、5.0、8.0、12.5、25.0、50.0μg·mL-1的线性溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样4μL，记录色谱图，以对映体峰面积为纵坐标，质量浓度(ρ，μg·mL-1)为横坐标，进行线性回归，结果表明，对映体在2.5～50μg·mL-1内与峰面积呈良好线性关系，回归方程为Y=4404.1ρ-2273.1，r2=0.9999(n=6)。
2.5日内与日间精密度
对含对映体分别为低(5.0μg·mL-1)、中(10.0μg·mL-1)、高(50μg·mL-1)3个浓度的对映体溶液进行日内(n=6)和日间精密度(d=3，n=6)考察，按“2.2”项下色谱条件进行测定，日内精密度低、中、高3个浓度的相对标准偏差(RSD)分别为1.14%、0.89%和2.03%，日间精密度低、中、高3个浓度RSD分别为2.28%、0.82%和2.01%。
2.6稳定性试验
取系统适用性溶液分别于配制后0、1、3、5、8、12h测定，记录色谱图，结果显示，阿托伐他汀钙峰面积RSD为2.72%，对映体峰面积的RSD为1.87%，对映体占阿托伐他汀钙峰面积百分比的RSD为1.30%(n=6)，表明溶液在12h内稳定。
2.7供试品测定
取两家企业的3批原料药按“2.1”项下方法配制，每批平行制备3份，按“2.2”项下方法进行测定，均未检出对映体，色谱图见图3。
2.8回收率试验
精密称取同一批号(2743173)原料药9份，每份约相当于阿托伐他汀钙30mg，分别置于10mLFig.3SFC-PDAChromatogramofatorvastatincalciumcrudedrug(Lot.2743173)量瓶中，分为3组，每组各加入对映体储备液0.60、0.90和1.20mL(其中0.90mL加入量参照《欧洲药典》中的对映异构体杂质限度0.3%计算)，加乙醇振摇溶解，稀释至刻度。按供试品测定项进行测定，记录色谱图及峰面积进行计算，结果见表1。平均回收率为100.40%，RSD为1.91%(n=9)。
3讨论
3.1色谱柱的选择
取少量消旋体对照品用甲醇溶解，在“2.2”项色谱柱筛选初始色谱条件(流动相为CO2/甲醇(80/20，V/V);流速:1.0mL·min-1;背压:13.8MPa;柱温40℃;进样量:1μL;检测波长:244nm)下对3根手性色谱柱AMY1[直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、CEL1[纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、CEL2[纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)]进行考察，固定相结构见图4。结果显示，在AMY1和CEL1色谱柱上目标物质在15min内出峰，但主峰与异构体杂质峰完全重合无法分离，在CEL2色谱柱上目标物质在10min内出峰且主峰与杂质峰完全分离，分离度达4.6，见图5。推测原因可能是固定相对溶质的立体选择性。手性固定相中最重要的手性吸附位置为氨基甲酸酯部位，阿托伐他汀钙中手性中心上的羟基可与固定相上的氨基或羰基形成氢键，根据空间位置的差异从而实现手性识别，AMY1和CEL1中固定相上的苯环引入推电子基团甲基时，会使羰基活性增强;而CEL2中苯环上引入吸电子基团氯时会使氨基活性变高，从结构上观察推测阿托伐他汀钙手性中心上羟基与固定相上羰基作用时的空间位阻比其与氨基作用时大，从而使阿托伐他汀钙在CEL2上的手性识别能力比在AMY1和CEL1上好。最终选择色谱柱CEL2进行后续条件优化。
3.2溶剂的选择
考察甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇4种溶剂对阿托伐他汀钙测定的影响，结果表明，阿托伐他汀钙在甲醇中溶解，在乙醇中微溶，在乙腈和异丙醇中不溶;对映体在甲醇中溶解，在乙醇中微溶。但因阿托伐他汀钙用甲醇溶解放置20h后，在主峰相对保留时间0.86处会产生一未知降解杂质，见图6。综合考虑阿托伐他汀钙与对映体在溶剂中的溶解度与稳定性，最终选用少量甲醇作为溶解溶剂用于样品粉末的初步溶解，选用乙醇作为稀释溶剂用于样品溶解后的定量稀释。相比EP9.0和BP2017中先分别用甲醇溶解对映体、无水乙醇/甲醇(50/50)溶解供试品后用无水乙醇稀释、正己烷定容的制备步骤，本实验选取的制备步骤更简便。
3.3流动相的优化
二氧化碳临界温度31℃，临界压力7.29×106Pa，对温度、压力有宽的选择范围，是最易获得的超临界流体之一，且对各类有机分子溶解性较好。在二氧化碳中添加改性剂可改善分离的选择性。分别以体积分数20%的异丙醇、乙腈、乙醇、甲醇为改性剂，在其他色谱条件相同的情况下，以甲醇为改性剂时，可获得良好分离度，选择甲醇为改性剂进一步优化比例与添加剂。尝试在改性剂中加入微量添加剂三氟乙酸，可使峰宽变窄，保留时间缩短。当以CO2/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)为流动相，背压为13.8MPa，柱温为40℃，流速为1.5mL·min-1时，阿托伐他汀钙与对映体可获得良好峰形与分离度，综合考虑保留时间、分离度，选择上述条件作为流动相。相比USP40、BP2017和EP9.0中采用正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(940∶60∶1，V/V/V)作流动相，文献[4]中采用正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(93∶7∶0.1，V/V/V)作流动相，本实验采用的流动相配制更简便，相同流速条件下有机溶剂使用量减少75%以上，更绿色环保。
3.4背压、流速、柱温与进样量的优化
分别考察了1.0、1.2、1.5mL·min-1的流速，35、40、45℃的柱温，13.8、15.2和17.2MPa的背压对分离结果的影响，结果显示，提高流速对峰分离度没有显著影响且可以使保留时间提前，改善峰形;背压对保留时间、分离度及峰形的影响均不显著;温度升高，峰宽减小，信噪比增加。综合考虑最终选用1.5mL·min-1的流速，13.8MPa的背压和45℃的柱温作为最终分离条件。
本实验考察了不同进样量对阿托伐他汀钙与对映体的峰形影响，取系统适用性溶液在优化后的色谱条件下分别进样1、2、3、4、5μL，结果表明，在进样量加大至5μL情况下会出现超载现象，色谱图中主峰与对映体峰峰形均较差，因此在不发生超载的前提下为尽可能提高检测灵敏度，选择进样量为4μL。
4结论
采用此超临界流体色谱方法对不同企业的3批进口原料药进行测定，均未检出对映体。建立的方法可在4min内完成阿托伐他汀钙与对映体杂质的完全拆分与杂质的测定，相比文献[4-5]中采用正相色谱条件约40min的拆分方法，此方法具有分离时间短，分离效率高，样品配制与操作简便，有机试剂用量少等优点，从进样到完成分离的过程中采用此方法的有机溶剂使用量仅为国外药典标准条件中有机溶剂使用量的3%左右，实现了超临界流体色谱在分析技术领域中绿色环保的理念，为阿托伐他汀钙中对映体杂质的质量控制和研究提供更快更有效的选择。
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