摘要优化布地奈德直肠原位温敏凝胶的制剂处方。采用冷法配制凝胶溶液，反转试管法测定胶凝温度，以胶凝温度为指标，采用星点设计-效应面法，对泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)以及羟丙甲基纤维素(HPMC)的用量进行优化，并考察在大鼠体内的胶凝情况，以Franz扩散池法考察释放性能。确定的最优处方为布地奈德0.002%，HPMC0.93%，P1882.00%，P40718.31%。优化确定了布地奈德直肠用原位温敏凝胶的制剂处方，其能够在直肠广泛与黏附，并长时间释放药物。
关键词布地奈德;直肠原位温敏凝胶;胶凝温度;处方优化;质量评价;星点设计-效应面法
布地奈德(budesonide)是一种具有高效局部抗炎作用的糖皮质激素，不良反应小，临床上已广泛用于呼吸道感染、溃疡性结肠炎等疾病的治疗[1-2]。其相对分子质量小，生理条件下难溶于水，无解离性[3]，首次通过肝脏时约90%被代谢，口服生物利用度只有10%～15%[1]。
溃疡性结肠炎是一种以腹痛、腹泻、黏液血便为主要临床表现的炎症性结肠炎[4-5]，发病多累及降结肠与直肠，黏膜表面与深部都可能被影响[6]。近年来随着人们生活水平提高，饮食结构多样、生活习惯改变等因素，其发病率逐年上升[7-8]，对于中、重度结肠炎临床多应用糖皮质激素类药物1～4周缓解症状后，再使用氨基水杨酸类药物，同时药效学研究表明血药浓度与疗效关系并不呈正相关，保持局部药物浓度是发挥药效的关键[9]。
目前，布地奈德临床用于治疗UC有结肠缓释片、泡沫剂和灌肠剂等剂型，结肠缓释片口服后在回肠末端或结肠部位释放，释药部位影响因素较多，具有不确定性，在远端直肠、乙状结肠等病灶的药物浓度较低，难以达到理想疗效;灌肠剂经直肠给药能直接将药物高浓度作用于远端直肠、乙状结肠等病灶，但是吸收消除较快，且易泄漏，使用不便[10-11]，而泡沫剂在肠道内分布范围更广，但也存在吸收消除较快的缺陷[12-13]。
因此，根据UC病理特点及药物性质，开发一种供直肠用的布地奈德新剂型将十分重要。直肠原位温敏凝胶具有溶液-凝胶转变的特点[14-16]，其通过直肠给药，既具有灌肠剂在肠道内分布范围广的优势，又可在给药位置凝胶化以实现定位黏附给药，实现药物的长时间滞留，是一种治疗UC较理想的剂型。本文拟将布地奈德制成直肠原位温敏凝胶，对其制剂处方进行优化筛选，并初步评价其质量性能，以期提高布地奈德在结直肠的药物浓度，延长其在结直肠的滞留时间，提高用药效果及便利性[17]。
1材料
1.1药品与试剂
布地奈德(批号:BD160402，含量98%，湖北葛人店药业有限公司);布地奈德对照品(供含量测定用，批号:110805-200508，中国食品药品检定研究院);泊洛沙姆407(P407，批号:WPAK592B)、泊洛沙姆188(P188，批号:WPAK539B)(德国Basf公司);羟丙甲基纤维素E5(HPMC，批号:20180201，江西阿尔法高科有限公司);苯扎溴铵(批号20160330，南昌白云药业有限公司);亚甲基蓝、磷酸(成都市科龙化工试剂厂);乙腈(色谱纯，批号:WXBC5443V，美国Sigma公司);半透膜(孔径220nm，上海亚兴净化器材厂)。
1.2仪器
BP211D型电子天平(德国Sartorius公司);智能透皮仪TP-6(天津精拓仪器科技有限公司);UltiMate3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)。
1.3动物
成年SD大鼠(雌雄各半，体重250～275g，成都达硕实验动物有限公司，合格证号:SCXK[川]2013-15)。
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2方法与结果
2.1布地奈德温敏凝胶制备
采用冷法制备，量取一定量的纯化水，在连续搅拌下依次加入HPMC、P188、P407、苯扎溴铵、布地奈德直至完全溶解，最后补加水至全量，置4℃冰箱中冷藏24h即得。
2.2胶凝温度的测定
量取凝胶4mL于试管中，放入温度可控约37℃的恒温水浴锅中，待溶液凝胶后，记录胶凝时间，取出试管，将试管反转180°，观察试管中的凝胶胶凝状态，凝胶开始融化并流动时的温度，即为胶凝温度[18]。
2.3温敏材料选择及用量的考察
以P407为温敏材料，分别配制P407质量浓度为14.0%、16.0%、18.0%、20.0%、22.0%、24.0%的温敏凝胶，测定胶凝温度，结果见图1。结果表明，随着P407浓度的增加胶凝温度降低，当浓度低至14.0%时，在37℃条件下未凝胶化，当浓度为19.0%时，其胶凝温度为24.3℃，室温条件即可转变成为凝胶。因此，拟选择P407的用量范围为16.0%～19.0%进行优化。
2.4胶凝温度调节剂种类及用量的考察
在配制得19.0%P407溶液中，分别加入3.5%的P188、PEG4000、PEG6000等材料，配制得不同凝胶溶液，分别测定其胶凝温度，考察各胶凝温度调节剂对胶凝温度的影响。结果表明，各凝胶溶液的胶凝温度均有升高，PEG4000对胶凝温度几乎无影响，PEG6000与P188相比对胶凝温度影响较大，在3.5%时胶凝温度已达39.1℃，不适合作为温度调节剂，且P188为P407的同系物，拟选择P188作为胶凝温度调节剂[19]。
在配制得19.0%P407溶液中，分别加入1.0%、2.5%、3.5%、5.0%、7.5%的P188，配制得不同凝胶溶液，测定胶凝温度，结果见图2。结果表明，随着P188浓度增加，胶凝温度逐步上升，当浓度达到5.0%时，胶凝温度已达到36.7℃，若继续升高浓度，凝胶溶液将难以在体温下转变为凝胶，因此，确定P188的用量优化范围为1.0%～5.0%，见图2。
2.5生物黏附剂用量的考察
在配制得19.0%P407、2.5%P188混合溶液中，分别加入0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%HPMC，配制得不同凝胶溶液，测定各溶液的胶凝温度，结果见图3。结果表明，随着HPMC比例的增加，胶凝温度呈现略微下降的趋势，选择HPMC的用量范围为0.3%～1.5%。
2.6星点设计-效应面法优化处方
2.6.1星点设计根据单因素实验结果，以处方中HPMC(X1)、P188(X2)、P407(X3)的用量作为考察因素，三者优化范围分别为0.3%～1.5%、1.0～5.0%、16.0%～19.0%，以3因素5水平星点设计实验优化温敏凝胶处方，水平代码分别为-1.732、-1、0、+1、+1.732，以胶凝温度(T)作为响应变量，因素与水平见表1。
2.6.2数据模型拟合利用Design-Expert8.0.6对实验数据进行模型拟合，对胶凝温度和各自变量的模型拟合如下:T=204.07416-15.410498×X3-6.18462×X2+23.02631×X1+0.57747×X3×X2-1.21780×X3×X1+0.30211×X32-0.23007×X22-2.27850×X12，r2=0.9930，P<0.0001，由r2和P可看出，该模型拟合度较优。2.6.3效应面优化与处方验证由于正常人体温度为37℃，为保证该温敏凝胶在室温下为液态，体温下能够迅速胶凝，设定胶凝温度为30℃。根据“2.6.2”模型方程，拟合的3D效应曲面图如图4，可看出胶凝温度随着P407浓度增大而降低，随着P188浓度增大而增大，HPMC对胶凝温度没有明显影响，且P407对胶凝温度的影响最大。以胶凝温度30℃为目标温度代入模拟方程中，在优化处方中选择5个具有代表性的处方，各制备3份，测定实际胶凝温度，对该优化方法的准确度进行验证和评价，实验结果见表3。结果表明，各处方胶凝温度实测值与预测值之间的偏差均在5%以内，表明拟合方程预测性较好。
2.7直肠滞留实验
取雄性SD大鼠15只，随机分为5组，每组3只，向优化的5个处方温敏凝胶中加入0.7%亚甲基蓝染料，采用大鼠灌胃针将各处方温敏凝胶1mL经由肛门，给予至肛门以上4cm直肠段，分别于给药后30min、3h、6h观察肛门周围毛色，以判断泄漏情况，放血处死3只大鼠，解剖并观察凝胶在直肠的分布黏附情况。结果表明，各处方给药后各时间段均未见明显泄漏，且均分布于肛门以上约2～13cm的肠段，分布面积较为广泛。
2.8体外释药性能评价
2.8.1色谱条件色谱柱:SWELLChromplusTMC18(4.6mm×250mm，5μm);流动相:pH3.2的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠3.17g溶于纯化水1000mL中，用磷酸调至pH3.2)-乙腈-无水乙醇(63∶37∶2);流速:1.0mL/min;检测波长:240nm;柱温:40℃;进样量:80μL。
2.8.2释放度测定采用Franz扩散池，供给池和接收池间以半透膜隔离。分别取5个优化处方的温敏凝胶各1.0g，加入到供给池中，将Franz扩散池置于37℃恒温水浴磁力搅拌器中10min，待溶液完全转变为凝胶后，再向接收池中加入恒温至37℃的磷酸盐缓冲液(pH7.4)释放介质15mL，设定搅拌转速为100r/min，分别于2，4，6，8，10，12h分别取样0.2mL，同时补充介质0.2mL，测定并计算布地奈德累积释放度，并绘制体外释放曲线，见图6。
采用OriginPro8.0软件分别用Ritger-Peppas、Weibull、Higuchi和一级动力学分布模型对5个处方的溶出曲线进行拟合，拟合度以校正决定系数(R2)和方差分析(P)等参数进行衡量，R2越接近1，P<0.05则表示拟合有统计学意义，拟合结果见表4，结果表明各处方溶出曲线均采用一级动力学分布模型拟合情况最好。T50和Td分别表示溶出50%和63.2%所用时间，见表5，T50均在3h以上，显示出一定的缓释性能。优选出的5个处方累计释放度均大于85%释放完全，处方1与处方2溶出行为相似(f2>50)，处方3与处方4溶出行为相似(f2>50)。处方1与处方2相比，处方1T50只有3.07h缓释性能不足，处方2在5个处方中HPMC用量最小且累积释放度最大，室温下具有较好的流动性，利于在肠道内分布，总体性能较优，故确定处方2为优选处方。
3、讨论
本研究将布地奈德制备成温敏凝胶。目前常用的温敏凝胶基质主要有泊洛沙姆P407、纤维素类、聚N-异丙基丙稀酰胺共聚物及其衍生物、壳聚糖等，其中纤维素类胶凝温度太高，聚N-异丙基丙稀酰胺共聚物及其衍生物有一定毒性，壳聚糖黏度太大且胶凝后不可恢复，因此，本研究拟选择温和、安全性好、生物相容性好、可逆反向胶凝的泊洛沙姆P407为温敏材料。
实验表明，单用P407时控制胶凝温度为37℃不易操作，此时P407浓度较低，胶凝温度对浓度特别敏感，如果配制不准确很容易导致胶凝温度出现较大变化，且此时胶凝时间较长[20]。因此，为了提高胶凝性能，需向其中加入胶凝温度调节剂如泊洛沙姆P188，使其胶凝性能更加稳定可控[21];布地奈德为难溶性药物，但由于凝胶胶束的形成增加了布地奈德的溶解度，使其能够溶解在凝胶中。为增加温敏凝胶在肠道的黏附力，使胶凝化后的凝胶在体内能够黏附于肠黏膜病灶而不泄漏，需加入一些生物黏附剂，如海藻酸钠、HPMC、CMC-Na和MC等[22]。在实验过程中发现，相较于其他黏附材料，使用HPMCE5作为黏附剂时，在保证黏附性能的情况下，凝胶溶液的黏度小，流动性与普通灌肠剂接近，给药后可确保其较大范围分布于直肠内。本研究对布地奈德温敏凝胶制剂处方的筛选思路，采用了以胶凝温度为评价指标，采用单因素实验确定制剂各辅料的种类及用量范围，在此基础上，采用星点设计-效应面法进行处方优化，确定了具有代表性的5个备选处方，并以体外胶凝温度、释放度及体内滞留性为指标，最终优化验证得到了布地奈德温敏凝胶的最佳处方，能达到预期的体内外温敏胶凝化、长时间滞留与持续释药的设计目标。
