摘要:微针是一种高效、安全的新型经皮药物递送技术，具有其他传统经皮给药技术不具备的优势，而其皮肤穿刺性能是该技术能递送药物的前提和关键。笔者综述了目前现有穿刺性能的评价方法，从微针自身的机械强度以及皮肤穿刺效果出发，分别描述了断裂力测定、压变性能测试、有机染料染色法、表皮水分流失法、电阻抗法、组织学切片、共聚焦显微镜法以及光学相干断层扫描法等的应用，并且介绍了各种方法的适用范围与优缺点，为其他研究者在微针穿刺性能评价方法的选择上提供参考及借鉴。
关键词:微针;穿刺性能;机械强度;评价方法
微针是指包含多个微型针头的阵列，针的长度一般为几十微米至几毫米，而其尖端直径为几十微米以下[1]。微针是一种高效、安全、新型的经皮给药技术，拥有其他传统经皮给药技术无法达到的优势[2]。第一，微针打破了经皮给药中的重大屏障———角质层对药物的阻滞，不仅使药物的递送效率大大提升，还使得大分子药物和亲水性药物的经皮递送成为可能。刘姝等[3]制备了胰岛素透明质酸微针，并以人离体皮肤模型考察了微针的体外透皮性能，发现与同剂量药物溶液相比，微针对胰岛素的体外经皮吸收有显著的促进作用。第二，由于其微小的结构特点，微针在应用过程中可以突破角质层障碍而不触及真皮内的神经组织，实现无痛微创给药，提高了患者顺应性[4-5]。目前，已有许多学者研究过不同材料制备的微针，如玻璃、糖、金属、硅、聚合物、水凝胶等;也有许多不同类型的微针，如中空微针、固体实心微针、可溶性微针和溶胀微针等，并已应用于局部麻醉[6]、免疫接种[7]、微量取样[8]、DNA给药[9]、皮肤美容[10]、蛋白质和多肽类药物递送[11]等方面。然而，目前微针产品商业化仍较少，究其原因很多，比如微针刺入过程中存在较多的力学问题，影响其穿刺有效性;微针使用过程中存在的安全性问题，如微针断裂造成有害残留等;较其他剂型而言，微针的载药量较小;微针的微创给药对皮肤造成的影响等。
其中，微针的穿刺性能是微针能否成功应用的决定性因素，也是限制微针发展与推广的一个关键，尤其是对由聚合物材料制备的可溶性微针来说至关重要。在穿刺过程中，由于皮肤的不均匀性、刺入过程中不可避免的移动等原因，微针会受到各种各样的力，而当外界的力达到一定程度时，会使微针发生断裂、弯曲等形变，影响微针的穿刺性能。因此，微针需要有一定的机械强度去克服这些因素可能带来的失败，且不同的穿刺方式、生物因素等都会影响微针的穿刺性能。目前还没有一种单独的体外方法能非常好地模拟微针在体内的穿刺过程，表征微针的机械性能和力学行为。笔者综述了目前现有的穿刺性能的评价方法，并且对其适用范围与优缺点进行了比较，为研究者们在微针穿刺性能评价方法的选择上提供一定的参考及借鉴。
1微针机械性能测定
1.1微针断裂力的测定
最初，Zahn等[12]将单根空心的多晶硅微针装载到玻璃片上，用夹子固定后，使用测力计对微针的尖端施加一个持续增大的力，直至微针断裂，微针断裂时测力计上显示的力即为微针的断裂力。微针技术发展至今，微针断裂力的测定方法也有了较大的发展。
由于微针在给药时，垂直皮肤进针，故轴向力机械性能测试是微针断裂力测定中常用的方法。该方法使用位移-力测试站对断裂力进行精确测定，一般对微针施加一个垂直于基底面的力，绘制力-位移的曲线，由此测定微针的断裂力[13-15]。Lee等[15]使用位移-力测试站对其制备的3×3微针阵列进行断裂力的测定:先将微针装备到移动传感器的表面，施加一个垂直于微针基底的轴向力，使传感器表面以恒定的速度(1.1mm·s-1)向一块坚硬的不锈钢平板表面移动，测试站记录移动过程中的力与位移，见图1。力-位移曲线通常反映了微针断裂时力的突降，发生突降瞬间的力即可认为是微针的断裂力，通过分析该曲线可以得到微针的断裂力，见图2。
除了轴向机械性能外，不规则的皮肤表面往往会导致微针刺入的不完全，从而引起微针的弯曲，特别是聚合物微针。因此，为较好地确保微针的刺入，考察微针的横向断裂力同样很有必要的。一般采用机械性能测试站进行试验，对微针使用一个横向力(垂直于微针且平行于基底面)直至微针断裂，过程中探头记录位移与力[13-14]。分析力-位移曲线，得到微针的横向断裂力(该横向断裂力是针对一整排微针而不是单根微针)。
由力-位移曲线，可以测得微针的理论断裂力，与皮肤所需的刺入力进行比较，从而判断微针是否可以刺入皮肤。当微针的断裂力小于皮肤穿刺力时，微针则会在刺入皮肤之前断裂，无法刺破皮肤。因此，研究者们[16-19]应进行皮肤穿刺力测定，并将其与微针的断裂力进行比较，从而预测微针的穿刺有效性。
1.2微针压变性能
上述微针的断裂力测定适用于脆性材料，采用相对韧性材料制备的微针在探头下压的过程中力-位移曲线不存在突降，表明微针只发生了形变而没有断裂。有研究者采用在微针上施加力，然后利用显微镜观察受压后微针的形变状况来直观反映微针的机械性能。将微针装在物性分析仪上，探头恒速向下移动对微针施加压力，当压力到达一个设定值后探头上移，显微镜下观察并测定施压前后微针高度的变化，以此反映微针的机械性能[20-22]。Donnelly等[23]使用物性分析仪对其制备的水凝胶型微针进行压变性能的考察，发现当施加的压力为0.36N·针-1时，微针针尖被明显压缩变钝，压力上升至0.71N·针-1时，微针开始变弯。
除了上述通过物性分析仪设定压力值，用显微镜观察微针的形变方法外，也有研究者将位移值作为参数，进行压变性能的表征。Zhu等[24]研究了韧性微针的压变性能，采用物性分析仪通过在设定相同位移值前提下，分析力-位移曲线的纵坐标来评判微针的机械性能，应力越大表明微针的机械强度越大。
2微针皮肤穿刺实验
虽然测定微针的断裂力和压变性能可在不使用离体皮肤的情况下模拟微针的理论穿刺过程，预测微针的穿刺有效性，但由于微针使用过程对穿刺的影响、皮肤与不锈钢板等平面存在较大差异等原因，微针实际的刺入效果是无法通过断裂力或压变性能准确预测的。因此，多数研究采用生物组织(通常是离体人皮肤或动物皮肤)来考察微针真实的穿刺性能。在这些研究中常使用以下方法来评价微针的穿刺有效性。
2.1有机染料染色
有机染料已经被广泛用于微针穿刺有效性的研究。这些染料可以选择性地对活性表皮的细胞进行染色，由于大部分使用的有机染料为水溶性的，所以这些染料不会染色皮肤的角质层部分，但可以标识出微针在皮肤上创造的微孔通道(水性环境)，是一种可以快速判断微针穿刺有效性的评价方法。目前微针研究常用的水溶性染色剂为亚甲基蓝、台盼蓝及罗丹明B[9，25-28]。Pearton等[9]使用亚甲基蓝溶液对微针穿刺后的离体人皮肤进行染色后观察发现，随着微针施加力度的增加，孔洞效果越明显，见图3。
也有其他研究者采用将染色剂直接载入微针从而染色微孔通道的方法，相比上述微针穿刺后的染色方法更加可控，染色效果更为显著。Chen等[29]将0.1%台盼蓝染料载入干扰素α2b可溶性微针中，刺入离体猪皮肤，通过观察皮肤蓝点数来反映微针是否刺入皮肤。另外，Kennedy等[30]将罗丹明B荧光染料直接载入可溶性微针中，将微针刺入小鼠耳背皮肤后通过荧光体内成像系统来反映微针是否能刺入皮肤及药物进入体内后的分布情况。
2.2表皮水分流失法
表皮水分流失法(transepidermalwaterloss，TEWL)是一种非侵入性的监测方法，能够灵敏、实时地提供皮肤表面的水分流失信息。TEWL虽然不能测定微针的刺入深度，但可以间接测定微针对皮肤的穿刺效果。研究表明[25-26，31]，微针刺入皮肤会造成皮肤角质层屏障的破坏，从而引起皮肤表面水分流失的增加。而当由微针产生的微孔通道关闭时，皮肤屏障功能恢复，皮肤表皮水分流失会恢复到正常值。因此TEWL法不仅可用于微针穿刺性能的研究，还可用于微针使用后皮肤屏障恢复等微针安全性的研究。Yan等[31]研究发现，当微针刺入后，TEWL值呈10～25倍快速增长，但随着时间的推移数值回到基线值，表明皮肤屏障功能的恢复。Kusamori等[32]同样发现微针刺入前后TEWL值会先剧烈增加，随后慢慢恢复至原来的水平，并与多次胶带剥离引起的角质层破坏现象进行比较，发现胶带组的TEWL值难以恢复至原来的水平。
然而，TEWL法确定微针刺入效果的准确性尚存在争议。Gomaa等[26]观察到微针刺入1h后，TEWL值与台盼蓝染色的微孔数量之间存在近似相关，他们推断TEWL值与微针所刺破的微孔通道数近似成正比关系。然而Chilcott等[33]的研究表明，TEWL不能用于预测药物的经皮递送。TEWL值可能受多种因素的影响，如不同皮肤间的差异、实验条件、大气温度、测定仪器等，这使得不同研究者的数据以及结论存在不一致性。
2.3电阻抗法
电阻抗法同样也是验证微针刺入皮肤的方法，被研究者广泛采用[16，19，34-36]。皮肤的电阻抗值主要取决于角质层，角质层相当于一层很薄的绝缘膜，当微针刺破皮肤角质层后电阻抗值发生改变。目前已经证实皮肤渗透性和皮肤电阻抗之间存在强烈的负相关性[35，37]，因此可以将电阻抗值作为衡量皮肤屏障功能的有效指标。Davis等[16]通过电阻抗法来验证微针是否成功刺入皮肤，采用3名成年男性作为受试者，当针刺入受试者皮肤时，针-皮肤回路的电阻迅速下降，使用该方法测得微针尖端半径在30～80μm所需的皮肤刺入力在0.08～3.04N，并且比较了压变法与电阻抗法的测试效果，表明电阻抗法检测更加灵敏、现象更加显著。图3微针使用不同给药力量刺入人皮肤后的亚甲基蓝染色图此外，也有研究者将电阻抗法用于评估微针使用的安全性。Kelchen等[38]利用电阻抗法研究老年人使用微针后微孔通道的关闭动力学，施加不同长度、数量的微针后在未知微孔通道是否处于封闭条件进行皮肤电阻抗测定，结果表明，老年人皮肤的微孔关闭较年轻人慢。
2.4组织学切片
组织学切片也是证明微针穿刺有效性的一种方法，可以在视觉上直观地反映出微针是否刺入皮肤以及刺入的位置，但该方法较为复杂。先将微针处理后的皮肤从大块皮肤中切除下来，在合适的溶媒中固定，然后立即放入液氮中冷冻。将样品切成6～12μm厚的石蜡切片，将切片用苏木精和伊红染色后观察微针刺入形成的微孔通道[18-19，39-41]，组织切片效果见图4。Leeladurga等[41]将制得的微针用恒定的拇指压力施加于猪耳皮肤后，通过组织学切片观察发现长度为0.6，1.2，1.5mm的微针均能有效刺入皮肤，且结合显微镜观察与软件处理，它们的刺入深度分别为363.25，521.16和642.34μm。
该法虽然可以让研究者直接观察到微针是否刺入皮肤并测量微针的刺入深度，但其属于破坏性方法，存在一定的局限性。Park等[42]制备了羧甲基纤维素微针，将其刺入猪皮肤后通过组织学切片染色观察发现:经过微针处理后，猪皮肤发生变形，产生约200μm深的微孔通道。该法存在的缺陷是:皮肤样品会在活体切割以及切片过程中受到机械性伤害以及拉力、压力等，容易改变皮肤的原本状态以及微针的刺入形态;在皮肤样品的固定和染色时，染色剂会对皮肤造成刺激，使皮肤收缩、微孔变形。Coulman等[43-44]使用同种硅微针处理皮肤后，通过比较组织学切片染色的图像与光学相干断层扫描图像，分析发现组织学切片组的微孔大于OCT组，表明组织学切片法会使微孔变大。
2.5共聚焦显微镜
共聚焦显微镜法多被用于测定微针在皮肤上制造的微孔通道尺寸。随着微针在皮肤上的刺入和移除，皮肤样品用含荧光物质的溶液处理后，采用激光共聚焦显微镜观察，共聚焦显微镜能检测这些荧光物质并测出微孔的深度[25，45-46]。此外，也可将荧光物质作为模型药物直接载入微针中，刺入皮肤后用共聚焦显微镜观察。例如，有研究者[47]利用共聚焦显微镜研究微针中药物的扩散情况。
该法是一种非侵入性的方法，不仅能用于体外也能用于体内研究，可以避免组织学切片的复杂操作过程。其主要的缺点为该技术的穿透和可视化深度在200～250μm，限制了其在测定由较长微针产生的位于较深皮肤层的微孔通道尺寸方面的应用。
2.6光学相干断层扫描
光学相干断层扫描(opticalcoherencetomography，OCT)是近十年迅速发展起来的一种成像技术，它利用弱相干光干涉的基本原理，检测生物组织不同深度层面对入射弱相干光的反射和散射信号，得到生物组织二维或三维结构图像。OCT被认为是唯一一种能提供角质层、活性表皮层和上真皮层的横向成像技术[48]。此外，OCT的穿透和可视化深度为2000μm，远远大于上述提到的共聚焦显微镜，是一种非侵入性的、实时检测微针皮肤穿刺效果的技术，被认为是目前检测微针刺入皮肤效果众多方法中较好的选择[40]。
较多的研究者[14，23，43，49]采用OCT法测定微针刺入皮肤的效果和深度，并实时检测皮肤中微针和微孔的情况，以得到更多的研究信息，包括微针的刺入深度以及微孔直径等。Lee等[47]制备了明胶和羧甲基纤维素为基质材料的微针，并将其刺入猪皮肤，利用OCT测定微针的刺入效果，OCT的2D横向图表明微针的刺入深度大约为250～300μm，纵向图表明微孔的直径大约为200μm，3D模型图表明微针刺入了皮肤，并在角质层上产生了微孔通道。
3结语
微针是一种能高效安全经皮递送药物的新技术，而有效穿刺皮肤是其发挥作用的前提，尤其是机械性能相对较差的可溶性微针，因此在微针的评价中，能快速准确检测其穿刺有效性及穿刺效果显得十分重要。微针的皮肤穿刺与许多因素有关，如微针的机械性能(如制备材料、几何形状、长度、密度等)、所加载的药物、给药方式和穿刺用的皮肤等。其中，微针的机械性能是影响微针穿刺性能的一个重要因素，然而，微针机械性能并不能完全模拟和预测微针的穿刺性能，因此需要结合能够直接观察微针是否刺入皮肤的方法和技术。
笔者综述了目前微针研究中常用的测定微针机械性能和皮肤穿刺性能的方法。然而每种方法都有其适用范围和应用限制，还没有一种方法能够很好地模拟和完全反映微针在实际应用中的穿刺性能。微针的断裂力和压变性能在不使用离体皮肤的情况下从理论上判断微针的穿刺有效性;微针刺入皮肤后的有机染色法、电阻抗法和表皮水分流失法是可以判断微针是否成功刺入的快速定性方法;组织学切片、共聚焦显微镜和光学相干断层扫描法可以分析微针刺入皮肤后的微孔参数。所以可以同时选择几种不同的方法对微针穿刺性能进行较为全面的评价。相信随着微针研究领域的不断发展，未来将会有更多新的技术和评价方法应运而生。
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