摘要：目的 改进高效液相色谱方法测定硫酸奈替米星注射液含量。方法 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱 (4.6mm×250mm, 5μm);流动相为庚烷磺酸钠缓冲液(0.6%庚烷磺酸钠溶解于0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);检测波长205nm;流速1.0mL/min;柱温35℃;进样量20μL。结果 硫酸奈替米星浓度在0.1~1.0mg/mL范围内与峰面积的线性关系良好，相关系数r为1.0000;平均回收率为98.3%，RSD为0.5%(n=9)。改进方法与微生物检定法所测结果无显著性差异。结论 该方法操作简便快捷、专属性强、线性范围宽，精密度和准确度高，重复性好，该方法可等效替代抗生素微生物检定法用于硫酸奈替米星注射液的含量测定。
关键词：硫酸奈替米星;高效液相色谱;抗生素微生物检定;等效替代
奈替米星是以西索米星为起始原料的半合成氨基糖苷类抗生素，系广谱杀菌抗生素，其生物利用度高，毒性较同类抗生素小，耐受性好，临床疗效高，在细菌感染方面具有较好的治疗作用[1-2]。目前中国药典、欧洲药典及日本药局方均采用抗生素微生物检定法测定硫酸奈替米星及相关制剂的含量。该方法虽然能直观反映含量与抗菌能力的关系，因为存在操作费时、专属性差、对操作人员要求高且易产生诸多操作误差等缺点，所以高效液相色谱法已成为抗生素含量测定的主流[3]。美国药典收载方法为高效液相色谱法，其流动相中含有高浓度离子对试剂，存在色谱系统平衡慢、检验成本高、对色谱柱伤害严重且分离能力差等问题[4-5]。为有效解决上述问题，本文对高效液相色谱条件进行了改进，使用低浓度的离子对试剂即能达到有效分离，方法准确、简便易行。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Shimadzu高效液相色谱仪(LC-20AB泵、DGU- 20A3R在线脱气机，SIL-20ACHT自动进样器，CTO- 20AC柱温箱，SPD-M20A紫外检测器)，Mettler Toledo XS205电子天平，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6mm×250mm, 5μm)，Millipore去离子水发生装置。
1.2 试药
奈替米星标准品(中国食品药品检定研究院，批号：130355-200702，577U/mg)，西索米星对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130635- 201301，56.0%)，奈替米星对照品(USP对照品，批号：1460500，110℃减压干燥至少3h，以干燥品计为65.5%)，乙腈为色谱级(默克股份两合公司)，庚烷磺酸钠(日本东京化成工业株式会社)，硫酸奈替米星注射液[64批次，规格为1mL:5万单位(相当于50mg) 和2mL:10万单位(相当于100mg)]分别由国内A、B、 C、D、E、F、G、H、I和J厂家提供，硫酸奈替米星原料(批号：01-05013-151103)由国内K厂家提供。
2 含量测定方法的建立
2.1 色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6mm×250mm, 5μm);流动相：庚烷磺酸钠缓冲液(0.6%庚烷磺酸钠溶解于0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调 pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);检测波长：205nm;流速：1.0mL/min;柱温：35℃;进样量为20μL。系统适用性溶液色谱图中西索米星峰与奈替米星峰间分离度不低于3.0，奈替米星峰与其相对保留时间1.1倍杂质峰的分离度应符合要求，连续进样6针，奈替米星峰面积的RSD不大于1.0%。
2.2 溶液的配制
流动相：庚烷磺酸钠缓冲液(0.6%庚烷磺酸钠溶解于0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液中，磷酸调pH至 2.5)-乙腈(77:23, V/V)。系统适用性溶液：取奈替米星标准品和西索米星对照品各约22mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
标准品溶液：取奈替米星标准品约22mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
供试品溶液：取硫酸奈替米星注射液1.00mL至 50mL容量瓶中，加水定容至刻度后摇匀，取5.00mL 至20mL，摇匀即得。
2.3 系统适用性试验
按“2.1”项条件，精密量取“2.2”项下各溶液 20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：空白溶剂基线平稳，各辅料对硫酸奈替米星含量测定无干扰。西索米星的保留时间约为10.4min，奈替米星的保留时间约为12.9min，西索米星峰与奈替米星峰间分离度为5.2，奈替米星峰与其1.1倍保留时间峰的分离度为1.8，以奈替米星峰计理论板数为10777，系统适用性溶液连续进样6针，奈替米星峰面积RSD为0.5%，符合HPLC定量分析的要求，典型色谱图见图1。
2.4 色谱柱的选择
选取Phenomenex-Gemini-NX C18、WatersXBridge Shield RP18及Agilent ZORBAX SB-C18 3个常用品牌的色谱柱，进行系统适用性考察的典型色谱见图2，西索米星峰与奈替米星峰，奈替米星峰与后相邻峰的分离度见表1。
结果表明：3款色谱柱均符合美国药典的要求，其中两款符合新建色谱系统适用性要求，说明本方法对色谱柱的耐用性比较好。
2.5 线性与范围
取奈替米星标准品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成0.1，0.2，0.25，0.5及1.0mg/mL的标准品溶液。精密量取各浓度标准品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以各溶液的浓度(mg/mL) 为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，绘制回归曲线并计算相关系数及回归方程，所得线性回归方程为Y=7838562X+24536(r=1.0000)。结果表明硫酸奈替米星浓度在0.1~1.0mg/mL范围内与峰面积的线性关系良好。
2.6 检测限与定量限
取线性项下浓度为0.2mg/mL的标准品溶液经系列稀释后进样检测，按信噪比约为3计算，奈替米星的检测限为20ng，按信噪比约为10计算，奈替米星的定量限为40ng。结果表明：该方法灵敏度高。
2.7 重复性
取A厂家批号为1511076的硫酸奈替米星注射液6 份，按“2.2”项制备供试品溶液，按“2.1”项进样分析，按外标法计算含量，所测含量RSD为0.20%(n=6)，表明该方法重现性良好，各样品含量见表2。
2.8 回收率试验
精密称定奈替米星(批号：01-05013-151103)12.5mg两份，分别置于50mL量瓶中，加水溶解，用水稀释至刻度，测定其含量。根据厂家处方工艺，分别称取EDTA-二钠、柠檬酸钠、L-半胱氨酸与硫酸奈替米星适量，按制剂处方量配制硫酸奈替米星注射液空白辅料母液。另取奈替米星(批号：01-05013- 151103)10、12.5及15.625mg各3份，分别置于50mL 量瓶中，分别加入相应处方量的辅料母液，加水溶解，用水稀释至刻度，作为回收率供试品溶液，分别精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定含量，计算回收率。
按处方量配制3个浓度水平的9份硫酸奈替米星溶液，记录所得色谱图峰面积，按外标法计算含量和回收率。平均回收率为98.51%，RSD为0.5% (n=9)，结果表明：本方法回收率良好，准确度较高，各浓度样品含量数据见表3。
2.9 溶液稳定性
精密称定奈替米星原料(批号：01-05013- 151103)12.5mg，置于50mL量瓶中，加水溶解，用水稀释至刻度，分别在0、2、4、6、8和10h时，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算各时间点样品含量的RSD。结果表明：各时间点含量的RSD为0.2%(n=6)，结果表明溶液至少在10h 内的稳定性是良好的。
2.10 小结
改进的高效液相色谱法测定硫酸奈替米星含量具有操作简便快捷、专属性强、线性范围宽，精密度和准确度高，重复性好等优点。
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3 液相色谱测定方法与抗生素微生物检定方法的等效替代可行性考察
3.1 中检院硫酸奈替米星标准品与美国药典(USP)硫酸奈替米星对照品转换系数的确定
由于中国药典和欧洲药典规定的含量测定方法均为抗生素微生物检定法(效价法)，因此中检院的标准品和欧洲药典的标准品标示的含量均为效价值，中检院标准品标示含量为577IU/mg，欧洲药典标准品标示含量为14656IU/瓶。USP标准为液相紫外测定方法，其对照品每瓶为500mg，为湿品，干燥条件：110℃减压干燥至少3h，标示含量：以干燥品计为65.5%。我们以卡尔费休氏法测定了USP对照品的水分为11.99%，将USP湿品对照品含量直接折算为 57.65%，然后以USP对照品湿品为对照品测定中检院标准品含量为56.9%。计算出纯品效价和绝对含量之间的转换系数F(IU/mg)为1.014。
3.2 含量测定及量效转换后结果与效价结果的统计学分析
以中检院标准品为对照品，按“2.1”项下方法对来自10个厂家的64批次硫酸奈替米星注射液进行含量测定，按外标法计算含量。结果表明，64批次样品均符合标准规定。同一样品由HPLC测得结果的 RSD较抗生素微生物检定法测得结果的RSD低，表明HPLC方法的精密度优于微生物检定法。
将高效液相色谱法测得的含量乘以转换系数F，计算出样品的标示含量，然后以该标示含量与微生物效价法测定的含量进行统计分析。采用SPSS软件将两种方法所测的结果进行统计分析，结果发现两种方法所得结果差异不显著(P=0.15>0.05)。说明两种含量测定方法有替代的可能。
3.3 量效统一性考察
根据USP通则1223.1中替代抗生素微生物检定法的验证要求，本实验以USP硫酸奈替米星对照品为对照，按照建立的高效液相色谱法标化中检院标准品含量，计算纯品效价和绝对含量之间的转换系数F。以中检院标准品为对照，测定样品的标示含量，乘以转换系数得到量效转换后效价含量。将量效转换后效价含量与微生物法测定的效价含量进行统计分析比较，结果符合Ep.2[-kMicro
