摘要:采用水蒸气蒸馏法提取野菊花挥发油成分，通过气相色谱—质谱联用技术鉴定了其中36种化学成分，主要为萜类化合物及其衍生物，其中姜黄烯和氧化石竹烯相对含量较高，均占10%以上.分别采用不同的抗菌活性检测模型测定了野菊花挥发油的抑菌活性.结果显示:野菊花挥发油对3株革兰氏阳性葡萄球菌和2株革兰氏阴性肠道杆菌的生长均表现出一定抑制活性，且对革兰氏阳性球菌的抑制能力稍强于阴性杆菌.带毒平板法活性测定结果表明，野菊花挥发油对荞麦立枯丝核菌表现出了较强的抑制活性，其抑制中浓度(IC50)值为0.02mg/mL.
关键词:野菊花;挥发油;气相色谱—质谱联用技术;抗菌活性;立枯丝核菌
0引言
植物挥发油属于植物的次生代谢产物，大多来源于植物的茎、叶、花、果实、种子以及表皮等部位，可以通过物理压榨、水蒸气蒸馏、溶剂提取等方式收集提炼得到[1].研究表明，植物挥发油主要为萜类化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫类化合物等，其中萜类化合物为植物挥发油的主要组成成分[2].研究发现，植物挥发油具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及保护心血管等药理作用[3-4]，其一直也是食品、医药以及农业环保等多个领域的研究热点[5].
野菊为菊科多年生草本植物，广泛分布于我国东北、华北、华中、华南及西南各地[6].野菊以全草入药，具有清热解毒、疏风散热、明目降压等功效，可以用于预防和治疗感冒、肝炎、痈疖等疾病[7].野菊花为野菊的头状花序部分，是入药主要部位，常用于提取分离药效成分.目前对野菊花挥发油的研究多集中在其挥发性成分的分析检测方面，对野菊花挥发油抗菌活性方面的研究相对较少.对此，本研究以野菊花为材料，提取其挥发性成分，同时采用不同抗菌活性检测模型测定野菊花挥发油对细菌和真菌的抑制活性，拟为野菊花挥发油的进一步开发利用提供依据.
1材料与方法
1.1材料
实验所用材料包括:硫酸链霉素、多菌灵，购自Sigma公司;甲醇、氯化钠、无水乙醇、葡萄糖、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、牛肉膏、蛋白胨、琼脂等试剂均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂公司;野菊花购自成都荷花池中药材市场.
1.2菌株
1)细菌.白色葡萄球菌(ATCC8799)、表皮葡萄球菌(ATCC35984)、金黄葡萄球菌(ATCC6538)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC50115)、大肠杆菌(ATCC25922)，由成都大学医学院提供.
2)真菌.荞麦立枯丝核菌，由成都大学农业部杂粮加工重点实验室提供.
1.3培养基
1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potatodextroseagar，PDA)用于真菌培养及活性测定，其配方为:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，加去离子水定容至1000mL.
2)营养肉汤培养基(Nutrientbroth，NB)用于细菌的活化及活性测定，其配方为:氯化钠5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水定容至1000mL，pH值调节至7.4.
1.4仪器
实验所用仪器包括:AUY-220型电子天平(岛津公司)，SXKW型恒温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)，DHG-9140B型恒温鼓风干燥箱、GHP-9080型隔水式恒温培养箱(上海琅实验设备有限公司)，UPT-II-20T型优普系列超纯水器(成都超纯科技有限公司)，LDZM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂).
1.5方法
1.5.1野菊花挥发油的提取.
野菊花于50℃低温烘干，粉碎，采用水蒸气蒸馏法提取其挥发性成分.称取一定量的野菊花干粉，按照料水比为1∶10(m/v)的比例，在微沸状态下提取野菊花挥发油，每次持续5～6h.收集挥发油，往其中加入少许无水硫酸钠，干燥，除去干燥剂后避光低温保存，总共提取2kg野菊花干样，称重计算挥发油得率.
1.5.2野菊花挥发油的气相色谱—质谱(GC-MS)分析.
1)色谱条件.色谱柱为毛细管柱，载气为高纯度氦气，进样口温度为290℃，压力49.5kPa，总流量24.0mL/min，流速1.0mL/min，线速度36.1cm/s.
2)升温程序.初设温度40℃，保持5min;以10℃/min升至150℃，保持5min;以5℃/min升至225℃，保持5min;以5℃/min升至250℃，保持2min;以10℃/min升至300℃，保持15min;分流比为20∶1;检样器温度220℃.
3)质谱条件.EI(70eV)，离子源温度为200℃，扫描范围为33～700m/z.
1.5.3野菊花挥发油对细菌的抑制活性.
1)挥发油溶液的配制.称取一定量的野菊花挥发油，溶于30%二甲基亚砜(DMSO)溶液中，配成初始浓度范围在6.25～100mg/mL的系列溶液，4℃低温保存，待测.
2)细菌活化.用接种环挑取少量菌种，接种到50mL营养肉汤中，于37℃下培养24～36h，用麦氏比浊管调节细菌浓度至108CFU/mL.
3)利用微量稀释法测定挥发油对细菌的抑制活性[8].吸取1mL上述菌液于新鲜的50mL营养肉汤培养基中，震荡摇匀，在洁净96孔板中加入90μL营养肉汤和10μL样品溶液，每个浓度重复4次，30%DMSO为阴性对照，硫酸链霉素为阳性对照.4)在37℃下，培养24～36h后，用肉眼观察细菌生长情况，判断最低抑制浓度(MIC)值，即无细菌生长的孔所对应的挥发油浓度为MIC值.在确定样品的MIC基础上，从MIC值所对应的无菌生长的孔以及比MIC浓度更高的孔中各吸取20μL培养液，接种于琼脂平板上，用三角玻璃涂布铲轻轻平推，使液体均匀分布，随后将平皿置于37℃培养24～36h，观察有无细菌生长，以培养皿中计数少于5个菌落作为药物的最低杀菌浓度(MBC).
1.5.4野菊花挥发油对荞麦立枯丝核菌的抑制活性.
1)样品溶液的配制.准确吸取一定量的挥发油置于洁净离心管中，用12.5%DMSO溶液依次稀释，使挥发油初始浓度范围在5～40mg/mL，每个浓度溶液体积均为1mL.阳性对照为多菌灵，阴性对照为12.5%DMSO.
2)真菌活化.用接种针挑取荞麦立枯丝核菌菌丝，接种至新鲜的PDA平板中央，25℃暗培养2～3d，待其菌丝刚好长满平板.
3)利用带毒平板法测定挥发油对立枯丝核菌的抑制活性[9].将PDA培养基加热融化，待其温度降至40～50℃时，将1mL样品溶液加入装有49mLPDA培养基的三角瓶中，摇匀，每个三角瓶倒3个平板，静置.培养基凝固后，用无菌打孔器在上述长满立枯丝核菌的平板上打孔，然后用接种针挑取菌饼接种到已凝固的培养基上，用封口膜将培养皿封口，于28℃下培养，48h后，采用十字交叉法测量菌落的直径，记录数据并计算相对抑制率.
4)数据统计.以供试样品终浓度对数为横坐标，抑制率换算成几率值为纵坐标，求回归方程(Y=aX+b)，并计算抑制中浓度IC50值.
2结果与讨论
2.1野菊花挥发油主要成分分析
实验采用水蒸气蒸馏法提取干燥的野菊头状花序，收集得到浅蓝色的野菊花挥发油成分，其具有野菊花的特殊香味，干燥后称重计算挥发油得率为0.32%(w/w).经GC-MS分析比对后，共鉴定出36种成分，主要为萜类化合物及其含氧衍生物以及脂肪族化合物，具体结果见表1.
由表1可知，相对含量较高的5种成分为姜黄烯(11.37%)、氧化石竹烯(10.53%)、胡椒酮(8.96%)、α-Copaen-11-ol(7.73%)和(S)-顺式马鞭草烯醇(6.39%)，其占总成分相对含量的44.98%.此外，左旋樟脑、左旋龙脑、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇、巴伦西亚橘烯等化合物的相对含量均在1%以上.
2.2野菊花挥发油对细菌的抑制活性
本研究采用微量肉汤稀释法测定了野菊花挥发油对5种临床常见致病细菌的抑菌活性，结果如表2所示.
表2数据显示，在供试浓度范围下，野菊花挥发油对3株革兰氏阳性葡萄球菌和2株革兰氏阴性肠道杆菌的生长均表现出了一定抑制活性.总体而言，野菊花挥发油对革兰氏阳性球菌的抑制能力稍强于阴性肠道杆菌，对白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相对较好，其MIC值均为1.25mg/mL，MBC值为2.5mg/mL，对金黄色葡萄球菌的抑制活性稍弱，MIC值为2mg/mL，MBC值为2.5mg/mL.野菊花挥发油对鼠伤寒沙门氏菌的MIC和MBC值分别为2.5mg/mL和5mg/mL，其对大肠杆菌的MIC和MBC值分别为5mg/mL和10mg/mL.
2.3野菊花挥发油对立枯丝核菌的抑制活性
本研究采用带毒平板法测定了野菊花挥发油对荞麦立枯丝核菌的抑制活性，结果如图1所示.
图1结果显示，野菊花挥发油对立枯丝核菌菌丝生长具有很好的抑制作用，且随着浓度增加，抑制作用随之增强，并呈现出一定的量效关系.在设定终浓度为0.024mg/mL条件下，野菊花挥发油对荞麦立枯丝核菌的抑制率超过50%，而浓度为0.096mg/mL时，其对荞麦立枯丝核病菌菌丝生长的抑制率高达80%.在此基础之上，进一步测定了野菊花挥发油对立枯丝核菌的抑制中浓度，其IC50值为0.02mg/mL(回归方程Y=1.7191X+1.3794).
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3结论
野菊为多年生草本药用植物，在我国的分布较为广泛.本研究采用水蒸气蒸馏法提取制备了野菊花中的挥发性成分，并采用气相色谱—质谱(GCMS)联用的方法对野菊花挥发性成分进行了分析鉴定.研究表明，野菊花挥发油的主要成分为萜类及其衍生物，其相对含量高于10%的成分主要为姜黄烯和氧化石竹烯.此外，胡椒酮、左旋樟脑、α-Copaen-11-ol、(S)-顺式马鞭草烯醇、左旋龙脑、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇和巴伦西亚橘烯等18个化合物的相对含量也在1%以上.同时，本研究采用不同的抗菌活性检测模型测定了野菊花挥发油的抑菌活性，结果表明，野菊花挥发油对3种革兰氏阳性葡萄球菌和2种革兰氏阴性杆菌均表现出了一定的抑制作用，其中挥发油对白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相对较好，其MIC值仅为1.25mg/mL，充分展现出了野菊花挥发油在医药领域有着较好的应用潜力.此外，本研究首次报道了野菊花挥发油对荞麦立枯丝核菌的抑制活性，其抑制中浓度IC50值低至0.02mg/mL，表现出了较好的开发利用价值，可为荞麦立枯病等病害新型防治药剂的研制提供新的思路.
