摘要:本研究旨在利用金标银染显色技术，构建同时检测禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克病病毒(MDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的可视化基因芯片。利用T-A法分别克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因，并利用本实验室已保存的AIV-np、NDV-f、ILTV-tk基因序列，设计寡核苷酸探针，制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV基因芯片阵列。引入生物素标记的引物进行PCR扩增，并与芯片进行杂交银染显色，肉眼观察检测结果，并对芯片的特异性、敏感性、稳定性进行评价，以及临床初步验证。成功克隆ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2共3个靶基因，测序鉴定其正确性。发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol·L-1，40℃条件下杂交2h，Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的质量浓度为4μg·mL-1，银染5min，可见明显的检测信号。特异性试验显示，ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应，且以鸡传染性支气管炎病毒为模板制备的PCR扩增标记不与ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV芯片杂交。芯片检测的灵敏度为1pg·μL-1。芯片在常温条件下保存60d，在4℃条件下保存75d仍可进行有效检测。临床病料检测结果与PCR检测结果一致。本研究成功构建同时检测ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金标银染可视化基因芯片，并确定其最佳反应条件，为临床标准化应用奠定了基础。
关键词:家禽;病毒检测;可视化芯片;金标银染
随着我国家禽养殖业集约化和规模程度的提高，家禽呼吸和免疫抑制类疾病的发病率逐渐上升。禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus，ILTV)是引发家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。传染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)、鸡马立克病病毒(Marek’sdiseasevirus，MDV)、禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)是引发家禽免疫抑制病的主要病毒性病原，临床症状相似，难以鉴别诊断，并表现出从单一的病原感染向多种病原混合感染方向发展的趋势。如J亚群ALV的env基因的可变区不断地发生变化，导致该病毒的抗原性不断地进化和改变[1-2]。2013年，新的AIV亚型H7N9被发现[3-4]。新出现的毒株，给家禽业造成了巨大的经济损失，也严重威胁着人类的健康。
基因芯片是继PCR后发展起来的一项具有快速、特异性好、敏感性强及高通量等优点的自动化基因检测技术，已被广泛地应用于药物开发、基因突变、基因表达等方面[5]。目前基因芯片在禽类病毒检测方面的应用大多是基于荧光扫描的基因芯片技术或酶与底物可视化显色技术[3，6-9]。然而荧光扫描比较昂贵，酶和底物显色所使用的尼龙膜或者纤维素性薄膜芯片不易保存，这极大地限制了芯片诊断在临床诊断中的应用。近年来，关于金标银染可视化显色技术与基因芯片相结合的文献报道呈递增趋势[10-11]，因其检测结果可脱离昂贵的传统荧光扫描仪，且操作简单，高灵敏性等特点，已广泛地应用于基因突变分析、疾病诊断、药物筛选等方面[12-14]，因此越来越广泛地被人们用于疾病的检测[2]。
考虑到家禽疫病防控急需，且目前尚未见ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV六种病毒金标银染可视化基因芯片的报道。因此，本研究以ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV以及ILTV为研究对象，通过金标银染显色，构建了一套能够同时检测这六种禽类病毒的可视化基因芯片检测技术，为家禽呼吸道和免疫抑制病的临床标准化诊断应用奠定基础，从而保障我国养禽业的健康发展。
1材料与方法
1.1生物材料
靶基因重组质粒T/AIV-np、T/DNV-f、T/ILTVtk、λ定位基因重组质粒，大肠杆菌DH5α由四川农业大学猪病研究中心构建并保存。MDV和IBDV组织液由四川农业大学动物医学院黄勇教授提供。ALV的DNA核酸由山东农业大学崔治中教授提供。临床病料采自四川安岳、大邑、彭州、蒲江等地区疑似禽白血病、马立克病、鸡传染性法氏囊病、禽流感、新城疫和鸡传染性喉气管炎患病鸡的喉气管、肺、脾、肝、肾及法氏囊组织。
1.2主要试剂
总RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、普通DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScriptRTReagentKit购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒提取试剂盒购自美国Omega公司;晶芯芯片点样液、晶芯光学级醛基基片、晶芯12样品芯片围栏购自北京博奥生物有限公司;金标链霉亲和素Nanogold-Streptavidin购自美国Nanoprobes公司;银染试剂SilverbufferA、SilverbufferB购自美国Sigma公司;封闭液按照0.5%BH4Na，25%Ethanol，0.75×PBS比例配制。
1.3主要仪器
晶芯?SmartArrayerTM16，微阵列芯片点样系统CapitalbioCorporation购自北京博奥生物公司;分子杂交仪购自美国Thermo公司;芯片杂交盒及杂交相关产品购自北京Capitalbio生物有限公司;高纯氮气瓶购自四川冠峰气体有限公司。
1.4ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因的克隆鉴定
λ定位基因的引物参考曹三杰[15]设计合成。利用DNAStar软件的Megalign对NCBI收录的ALV、MDV、IBDV毒株的基因序列进行比对分析，以Primer5.0设计3对引物(ALV的env基因，MDV的meq基因，IBDV的vp2基因)，靶基因扩增长度在200～800bp之间，Tm为(55±5)℃，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成(表1)，用生物素对靶基因下游引物的5'端进行修饰。
提取IBDV毒株的总RNA，并将其反转录为cDNA，提取ALV、MDV的DNA，以cDNA/DNA为模板扩增目的基因，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收产物连接pMD19-TSimple载体，并转化DH5α感受态细胞，提取质粒后阳性的重组质粒送上海生物工程有限公司测序后保存备用。取ALVenv、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f、ILTV-tk和λ菌落分别进行菌液PCR，用生物素对靶基因下游引物的5'端进行修饰。
1.5探针设计与芯片制备
针对每个靶基因序列片段，各选取一条单链核酸序列作为寡核苷酸探针，确保各探针的Tm值为75℃±5℃，长度为45bp左右，并在每条寡核苷酸探针的5'端添加15个T碱基作为连接臂，同时进行氨基化修饰。探针由上海生物工程有限公司合成(表2)。
将点样缓冲液和ddH2O按1∶4的比例混匀，用以稀释合成的寡核苷酸探针，调整其终浓度为50μmol·L-1，按照设计好的检测阵列排布进行非接触喷样方式喷样(图1)。喷样结束后，紫外交联5min，芯片置于湿盒内，37℃水合过夜。随后，在37℃条件下，封闭液封闭30min。取出芯片，超纯水清洗5次。自然干燥，置于4℃保存备用。
1.6可视化基因芯片的检测
用生物素标记的引物分别扩增ALV-env、MDVmeq、IBDV-vp2、NDV-f、AIV-np和ILTV-tk六种靶基因，并将其PCR产物等量混匀，于100℃水浴变性5min，立即冰浴3min，防止DNA双链复性。随后将PCR产物混合液加入含围栏固定的芯片阵列区域，40℃条件下杂交120min，杂交结束后，超纯水洗净后自然干燥。将质量浓度为4μg·mL-1的NanogoldStreptavidin的链霉亲和素溶液缓慢加入到芯片对应的阵列区域，37℃孵育30min。超纯水洗净后自然干燥。避光条件下，将银染试剂中的SilverbufferA和SilverbufferB等体积混匀，取200μL混合液加入芯片阵列区域，观察并记录芯片上可视化信号出现的时间。当可视化芯片阳性对照相应位置出现明显的杂交信号，而阴性对照相应位置无明显的杂交信号时，清洗芯片，终止显色。眼观可视化芯片结果，在芯片相应位置若出现明显黑色银染信号，即判定为杂交阳性，反之则判定为杂交阴性。
1.7可视化基因芯片的质量评价
1.7.1特异性试验ALV-env、MDV-meq、IBDVvp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk的单链靶基因，单独与芯片进行杂交显色，眼观杂交结果。
1.7.2敏感性试验使用ddH2O将提取的靶基因质粒(初始质量浓度为1ng·μL-1)依次进行101～105倍稀释，PCR扩增标记，扩增产物混匀后与芯片进行杂交显色，眼观杂交结果。
1.7.3稳定性试验将同一批生产的芯片，分别放置在常温和4℃条件下密封保存。分别在30、60、75、90d随机抽出一张芯片，按照“1.6”步骤，与生物素标记的靶基因进行杂交，银染显色眼观结果，以评价芯片的稳定性。
以上特异性、敏感性及稳定性试验均重复三次。
1.8临床样品的初步验证
将收集的51份疑似患禽免疫抑制性和呼吸道疾病的青脚麻鸡、白羽肉鸡和乌鸡的喉气管、肺、肾、脾、肝、法氏囊组织，混合研磨匀浆后，灭菌的PBS匀浆稀释，-70℃条件下反复冻融三次，4℃，12000r·min-1离心10min，取上清500μL进行RNA和DNA的提取。提取的RNA反转录为cDNA。分别用临床样品的PCR技术和基因芯片同时进行检测，对比两者检测结果。
期刊推荐：《畜牧兽医学报》本学报是中国畜牧兽医学会主办，创刊于1956年7月，刊登较高水平的学术论文和企业研究报告以及对生产实践具指导性、启发性的文章。为全国中文核心期刊、中国自然科学核心期刊，并被国内外重要引文数据库及文摘性期刊收录。
2结果
2.1靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定
成功扩增ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2靶基因片段，测序结果显示，与NCBI中收录的同一病毒的不同毒株靶基因序列具有99%以上的相似性(表3)。对ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDVf、ILTV-tk进行菌液PCR扩增结果显示(图2)，PCR扩增的目的片段与预期大小一致。
2.2基因芯片制备的初检
2.2.1阳性定位基因的检测以λDNA定位基因为模板进行靶基因扩增标记，将λDNA扩增产物与含6种病毒探针的芯片进行杂交，银染显色，肉眼观察试验结果。结果显示阳性质控λDNA定位基因杂交斑点明显可见，阴性对照和其他探针斑点没有可见杂交斑点(图3)。表明本研究制备的醛基基片及阳性定位基因质量可靠。
2.2.2共检芯片全基因的检测6种病毒6个探针基因的全部探针位点均可以看到明显的杂交斑点，阳性对照斑点明显，阴性对照没有可见杂交斑点，表明制备的可视化共检芯片、选用探针基因质量可靠(图4)。
2.3可视化基因芯片的质量评价
2.3.1特异性试验评价ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk单独与可视化芯片杂交时只在芯片的相应位置出现了肉眼可见的杂交斑点，且各个探针之间无非特异性杂交的情况。使用IBV-n基因扩增产物与可视化芯片杂交后，芯片的相应位置无肉眼可见杂交信号斑点，杂交结果呈阴性(图5)。说明本试验构建的基因芯片具有高的特异性。
